[发明专利]一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法

权利要求书

1.一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）引物设计

根据GenBank登录号：AF081136.1、KJ188221.1、AY260172.1、AF081137.1、U97052.1，用DNAMAN软件比对羊泰勒虫18SrRNA基因序列，找到基因保守序列靶基因位点，设计了特异性引物序列I为：上游引物Tf：5'ATTCCCGCATCCTATTTAGCAG3'和下游引物Tr：5'CGACTCCTTCAGCACCTT3'；

根据GenBank登录号：JQ917906.1、AY149637.1、JF514513.1、AF311303.1，用DNAMAN软件比对羊无浆体16SrRNA基因序列，找到基因保守序列为靶基因位点，设计了特异性引物序列II：上游引物Af：5'ACACGGTCCAGACTCCTACG3'和下游引物Ar：5'AGGTACCGTCATTATCTTCCCTACT3'；

（2）羊泰勒虫DNA及羊无浆体DNA的提取：使用血液基因组DNA提取试剂盒按照说明书提取待测血液样品DNA；

（3）以设计的特异性引物序列I的上、下游引物和特异性引物序列II的上、下游引物为引物，以Theileriaspp和Anaplasmaspp阳性样品及阴性对照为模板，PCR混合液加入PCR扩增管中，进行双重PCR反应条件优化及双重PCR特异性试验、敏感性试验及重复性试验；

（4）将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；

（5）取PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳。

2.根据权利要求1所述的检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，其特征在于：所述扩增产物中羊泰勒虫属的核苷酸序列大小为298bp，羊无浆体属的核苷酸序列大小为139bp。

3.根据权利要求1所述的检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，其特征在于：步骤（3）中PCR混合液包括：采用25μL的PCR反应体系，2μL模板，2.5μL10×PCRBuffer缓冲液，2μLdNTPMixture，特异性引物序列I上、下游引物各0.47μL，特异性引物序列II上、下游引物各0.53μL，0.2μLTaqDNA聚合酶，灭菌水补至25μL，混匀；其中以上各个引物的浓度均为25μM。

4.根据权利要求1所述的检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，其特征在于步骤（4）中PCR的扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性35s，56℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环，72℃后延伸7min。