[发明专利]一种鉴定马蹄莲软腐病抗性的离体叶盘接菌方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种园艺作物的病害抗性鉴定方法，具体涉及一种鉴定马蹄莲软腐病抗性的离体叶盘接菌方法，属于农业植保技术领域。

背景技术

马蹄莲为天南星科(Araceae)多年生草本植物，是马蹄莲属(ZantedeschiaSpreng.)内种的统称。其原产于非洲中南部，因具有似马蹄型的漏斗状佛焰苞而得名。由于形态高雅，色彩艳丽等特点，被誉为“彩色百合”。它的应用非常广泛，除作切花和盆花外，还可为花饰、花束和花篮等提供特有的素材。目前，欧美如新西兰、荷兰和美国等是马蹄莲育种和生产栽培的主要国家。

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorasubsp.Carotovora)是一种对马蹄莲具有毁灭性的细菌病害，它能使马蹄莲因叶片、叶柄和球(根)茎等组织和器官发生坏死、水浸软化、腐烂变质及倒伏死亡而减产，并且会迅速蔓延直至造成马蹄莲完全绝收。该病堪称马蹄莲的“癌症”，严重影响马蹄莲的产量和品质，极大地限制了马蹄莲的规模化生产和应用。其防治俨然已成为世界性难题，迄今为止并无有效方法，多在发病前后采用化学药剂如链霉素等以及加强田间管理等措施进行补救。

事实上，马蹄莲不同品种或谱系对软腐病病菌存在不同程度的敏感性，这就意味着它们之间的抗病能力存在巨大的差异。因此，加强抗病品种的选育和推广是控制马蹄莲软腐病非常有前景的手段之一。但因为缺乏有效的抗性鉴定方法，我们对当前生产上马蹄莲品种的软腐病抗性特点并不了解。

利用活体植株为材料，对其叶片、叶柄和种球等组织或器官的注射或喷洒胡萝卜软腐果胶杆菌是马蹄莲当前常见的软腐病抗性筛选方法。然而，其存在以下问题：一是因为胡萝卜软腐果胶杆菌为内生菌，在活体接种后最终会导致整个试验植株死亡或携菌生存进行二次传播；二是因为我国的马蹄莲种球多数从国外进口，每种球大约30-50元/粒，价格昂贵，活体接种会导致资源浪费，鉴定成本增加；三是在抗病鉴定过程中，存在病斑侵入和腐烂等指标无法衡量，定量分析不准确和评价效果差等问题。

为解决以上问题，通过离体接种马蹄莲组织或器官的技术被陆续开发。该方法在保护植株的同时也能实现对抗感病特性的准确评估，具有避免浪费而且兼顾有效的优点。其中一种就包括叶圆盘浸泡法(Snijderetal.2002；EuropeanJournalofPlantPathology)，它首先通过打孔器沿着叶片主脉两侧在叶片上获取直径2.2cm的圆盘，而后将其浸泡于包含菌液的多孔板中在20℃条件下培养，4天后根据统计发病面积利用迭代重复加权残余最大似然法(IRREML，IterativeReweightedResidualMaximumLikelihoodAlgorithm)进行统计分析和评价。但该方法也具有以下缺点：首先是观察周期比较长，至少需要四天(96h)才能观察；其次是统计方法比较复杂，需要一定的数理统计学知识，普通育种家或研究者难以有效掌握。

发明内容

本发明在保留现有方法的植株不易受到伤害，鉴定成本低，操作步骤简单和易于控制等优点的同时，建立了一种观察时间更短、统计和分析方法更简单但评价结果同样可靠准确的鉴定方法。本发明的最终的目的是希望通过抗性品种的筛选为今后实现国内马蹄莲抗病育种提供有效的技术支持和帮助。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种鉴定马蹄莲软腐病抗性的离体叶盘接菌方法，其特征在于，每个被鉴定品种或谱系随机挑选三份成熟健康的叶片，清洗消毒后首先在叶片中上部以主脉为中轴用打孔器获取直径为1.5cm的叶圆盘，重复取12次；之后利用注射器沿叶圆盘的主脉下部注射100μl胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液，并将其浸泡在包含10ml胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液的12孔培养板中；同时再将其放置在生化培养箱中28℃恒温培养，期间用无菌水补充1次，60小时后将鉴定材料取出，目测观察叶盘发病面积并根据分级标准进行分级；计算病情指数，最后依据计算的病情指数确定各品种或谱系的抗感特性变异情况。

在本发明中，优选的，包括如下步骤：

(1)胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液的制备

将胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种接种于肉汁胨(NA)平板培养基上，28℃培养，挑取平板上的单菌落接种到LB培养基中，在37℃恒温培养箱中进行活化并扩大培养24h，4000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀中加入无菌水配制成胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种细菌悬液；

(2)参试品种的叶片处理