[发明专利]人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物及试剂盒。

背景技术

结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，结直肠癌的发病率和病死率均在不断上升，在全世界排名第二。临床诊治实践表明，早期的结直肠癌无明显的临床症状，但是手术治疗可使早期结直肠癌得到根治，对于I、II期的结直肠癌患者，外科手术的5年生存率分别达到90％和75％，而对于晚期患者则不足10％。且晚期结直肠癌经化放疗联合分子靶向治疗后平均生存时间仍不足30个月。因此通过对结直肠癌的早期筛查和诊断对提高肿瘤治愈率、降低肿瘤转移率和复发率具有十分重要的意义。

结肠镜是发现早期结直肠癌的重要方式，然而它是一种侵入性检查，要求完全彻底的肠道准备，进行大规模筛查难度较大。而纤维结直肠镜对于直径小于5mm的病变漏诊率高达到27％。大便潜血试验是一种非侵入手段，但是敏感性较差，在15-80％左右，特异性也较低。

众多研究表明，DNA甲基化发生在结直肠癌形成的早期甚至起始阶段，并且DNA甲基化状态改变与结直肠癌的发生发展关系密切，贯穿整个肿瘤发生发展过程。以单个基因甲基化为粪便DNA筛查标记，检测大肠癌敏感性达38％-94％，检测大肠腺瘤的敏感性达31％-70％，特异性达79％-100％。而且甲基化标记还具有稳定性强和容易检测的特性。同时，大量研究表明，粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA；又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使得从粪便中提取的DNA质量较好，因此粪便样本DNA甲基化检测作为一种检测性能较好、高特异性和非侵入性手段，能根据其阳性结果对疑似病例进行进一步检测，可作为筛查诊断结直肠肿瘤的一种重要的辅助手段，具有很重要的筛查早期结直肠癌的临床价值。

目前已有大量文献报道了一系列在结直肠癌中甲基化程度异常的基因，如NDRG4、TFPI2、SEPT9、BMP3和VIM等等。N-Myc下游调控基因4(N-mycdownstream-regulatedgene4，NDRG4，又名SMAP-8或者BDM1)位于染色体16q21-q22.3，有17个外显子，是一种抑癌基因。近年来研究认为NDRG4基因存在于结直肠癌肿瘤组织和体液中，且可能具有稳定性高、可重生的特点，这为提高结直肠癌的早期筛查和诊断提供了一个全新的视角。Veerle和他的同事发现NDRG4启动子的甲基化可作为生物标志物，用于粪便样品检测直肠癌，敏感性为61％，特异度为93％。赵慧霞等从84例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪便、尿和血中提取DNA，应用巢式甲基化特异性PCR检测NDRG4基因甲基化水平。

组织因子途径抑制因子基因(tissuefactorpathwayinhibitor2，TFPI2)定位于7q22区域，包含5个外显子，是Kunitz型丝氨酸蛋白质抑制物，对细胞外基质的降解和重塑起到重要的作用。TFPI2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI2的表达水平也会随之显著下降。有研究证实，与肿瘤产生相关的TFPI2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关。已经有相关研究报道TFPI2可作为结直肠癌粪便DNA筛查的标志物之一。

在现阶段，采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对结直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但在应用于结直肠癌的早期诊断方面还很不成熟，诊断准确率、特异性、有效性不高等缺点尚有待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的结直肠癌检测标志物以及试剂盒，具有定量、灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引物、甲基化引物和探针；

其中，三种基因的捕获引物分别是：