[发明专利]一种高纯度大米谷蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种高纯度大米谷蛋白的提取方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、将大米研磨成米粉；

二、将米粉用正己烷脱脂3～5次，得到脱脂米粉；

三、将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；

四、对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白3～5次；

五、合并每次浸提收集的上清液，用浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液将上清液进行蛋白沉淀；

六、用PBS缓冲液清洗沉淀3～5次，将清洗后的沉淀真空冷冻干燥，即得到大米谷蛋白；

步骤一中将大米研磨成米粉的具体方法为：用粉碎机粉碎新鲜大米，每次15-20s，总共30-40次；

步骤二中将米粉用正己烷脱脂的具体方法为：

A、将米粉与正己烷按照1g:4～6mL的比例混合，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；

B、重复步骤A2～4次，将收集的沉淀于30℃水浴中晾干，得到脱脂米粉；

步骤三中将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的具体方法为：

A、将脱脂米粉与去离子水按照1g:10～12mL的比例混合，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

B、将步骤A的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

C、将步骤B的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡4h，离心后收集沉淀，即为去除了清蛋白的沉淀；

D、然后将去离子水换为浓度为5％(w/v)的NaCl溶液，每次加的5％NaCl溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白和球蛋白的沉淀；

E、然后将去离子水换为58％(v/v)的正丙醇溶液，每次加的58％的正丙醇溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的沉淀；其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min；

步骤四中对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白的具体方法为：

①向步骤三收集的沉淀中加入浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸溶液，沉淀与乳酸的比例关系是1g:10～12mL，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

②重复步骤①2～4次，每次离心后均收集沉淀和上清，其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min；

步骤五中用TCA溶液将每次浸提得到的上清进行蛋白沉淀的具体方法为：

将步骤四中每次收集得到的上清液加入浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液，上清液与TCA溶液的体积比为1:3～5，避光条件下于0～4℃冰浴15～20min；然后离心弃掉上清液，取沉淀，其中所述离心的条件为：1～6℃，10000g，20min；

步骤六中真空冷冻干燥的条件为：真空度≤15Pa，冷阱温度为50℃～60℃，样品温度为-30℃～-20℃，冻干时间为20h～24h。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度大米谷蛋白的提取方法，其特征在于步骤六中用PBS缓冲液清洗沉淀的具体方法为：

将步骤五中每次收集的沉淀与PBS缓冲液混合，于25℃130rpm振荡0.5h，离心后收集沉淀，所述PBS缓冲液为0.05M且pH6.5的磷酸盐缓冲液，每次使用的量与每次使用1％乳酸的量相等，其中所述离心的条件为：1～6℃，10000g，20min。