[发明专利]一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的方法

权利要求书

1.一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物：TLR8-q-F：5'-AGTTTCACCCGCAGATTG-3'；TLR8-q-R：5'-CTGGGATGCCTCCTATGT-3'；

以及作为内参基因的牙鲆β-actin基因特异性上下游引物：β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3';β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速检测牙鲆TLR8基因的方法，其特征在于按如下步骤：

（1）使用下述引物进行该基因的检测：

符合荧光PCR反应特点的该序列特异性上下游引物：

TLR8-q-F：5'-AGTTTCACCCGCAGATTG-3'

TLR8-q-R：5'-CTGGGATGCCTCCTATGT-3'

以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异性上下游引物：

β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3'

β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'；

（2）总RNA提取与纯化：采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆脾脏中提取得到纯化的牙鲆脾脏总RNA；

（3）cDNA第一链合成：以牙鲆脾脏总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μL；

（4）实时荧光PCR：以上述合成的cDNA第一链为模板，上述（1）中TLR8-q-F和TLR8-q-R、β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数；

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

实时荧光PCR扩增参数按照Promega?公司GoTaq?qPCRMasterMix说明书中针对ABI7500型荧光定量PCR仪推荐的方法设置如下：

95℃2min；

95℃3s；55℃30s；(40个循环)；

（5）牙鲆脾脏组织中TLR8基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算牙鲆病原感染各时间段下的△Ct、2^-(ΔΔCt)值，计算方式如下：

△Ct=Ct—Ct内对照（β-actin）

△△Ct=△Ct—△Ct（0时健康牙鲆）

以2^-(ΔΔCt)数值表示牙鲆脾脏中TLR8基因相对于健康牙鲆TLR8基因的表达量。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为10μmol/L的贮存液，工作浓度为0.6μmol/L。

4.权利要求1所述的采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR8基因表达的特异性引在制备判断牙鲆是否感染病源以及病原鉴定方面的应用。