[发明专利]重组Cytohesin拮抗多肽TAT-Sec7及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药领域，具体涉及一类重组Cytohesin拮抗多肽的制备及其应用。

背景技术

肿瘤是机体的细胞异常增殖形成的新生物，常表现为机体局部的异常组织团块。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，所谓的癌症即指恶性肿瘤。恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗等，但是癌细胞的转移给这3种治疗方式增加了极大的困难，肿瘤转移已经成为癌症患者死亡的主要原因，而市场上罕有抑制肿瘤转移的药物。因此开发能够抑制肿瘤转移的药物成为减少癌症死亡率，提高患者生存率的重要途径。

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylationfactors，ARFs)是真核细胞中广泛表达且高度保守的GTP结合蛋白，是Ras超家族成员之一。ARFs家族共有6个成员，分别属于3个亚型。其中Ⅰ型包含ARF1、ARF2和ARF3；Ⅱ型包含ARF4和ARF5；Ⅲ型仅含有ARF6。ARF6作为一种特殊亚型，定位于细胞膜和胞内体。ARF6的生物学功能主要包括，调节细胞内吞、质膜运输和细胞骨架重排。近年来发现ARF6还具有促进黑色素瘤细胞迁移、乳腺癌细胞侵袭和胶质瘤细胞增殖的功能。像其他小GTP酶一样，ARF6在有活性的GTP和无活性的GDP两种结合构象之间转换，其中ARF6·GDP到ARF6·GTP的转换需要鸟苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactors,GEFs)的催化。近年来研究表明，GEF蛋白家族中能催化ARF6的GDP/GTP的转化的交换因子有三种，分别是Cytohesin、EFA6和BRAG。三种蛋白都包含Sec7结构域。Sec7是一个大约有200个氨基酸长度的催化结构域，与ARF6的GTP酶活性密切相关。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的重组Cytohesin拮抗多肽TAT-Sec7及其制备方法，该重组多肽具有拮抗ARNO/Cytohesin与ARF6的结合或催化，从而抑制ARF6的活化特性。该重组多肽融合蛋白可用于制备治疗肿瘤转移的药物。

本发明所提供的重组Cytohesin拮抗多肽TAT-Sec7，其氨基酸序列如SeqIDNo.1所示。

本发明所提供编码所述重组Cytohesin拮抗多肽TAT-Sec7的基因如SeqIDNo.2所示。

本发明含有编码所述重组Cytohesin拮抗多肽基因的载体，为含有T7启动子的原核表达载体pET-20b。

本发明含有编码所述重组Cytohesin拮抗多肽的工程菌，为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明所述重组Cytohesin拮抗多肽的制备方法，是通过在编码所述Cytohesin基因Sec7片段的5’端添加穿膜肽的基因序列，从而形成融合基因，将该融合基因克隆至原核表达载体并在大肠杆菌细胞中进行诱导表达，然后进行蛋白质分离纯化获得融合蛋白。

应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，并转化相应的宿主。

本发明实验方案，以pET-20b为表达载体，BL21(DE3)作为宿主，制备重组Cytohesin拮抗多肽的具体步骤如下：

1)设计引物，以K562细胞cDNA为模板，扩增出Sec7序列。

2)构建重组表达载体：通过PCR方法扩增融合基因，亚克隆至原核表达载体pET-20b中，转化大肠杆菌DH5α，挑选重组子，通过测序验证重组表达质粒。

3)培养转化后的宿主细胞，诱导表达重组Cytohesin拮抗多肽：将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子，将筛选的阳性重组菌BL21(DE3)/pET-20b-Sec7单菌落，接种到LB培养基中，37℃振荡培养16h。然后按5％比例转接到新鲜LB培养基中，进行温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化，经研究证实，OD值为0.6时，1mMIPTG在37℃诱导3h，超声波(100w，超声2s，间隔2s)破菌，适于重组Cytohesin拮抗多肽的高表达。

4)分离纯化重组Cytohesin拮抗多肽：收集菌体，破碎后离心，收集上清，进行亲和层析，再经洗涤、脱盐，即得重组Cytohesin拮抗多肽融合蛋白。