[发明专利]一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法

权利要求书

1.一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体，其特征在于：该转移载体为在pBluescript II SK(+)骨架中插入了如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，该序列插入在pBluescript II SK(+)骨架中KpnI、SacI的两个酶切位点间，该转移载体中包含如SEQ IDNO：3所示的TK片段。

2.一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）扩增重组臂：以鸡痘病毒FPV的基因组为模板，扩增左右同源臂TKL片段和TKR片段，其中TKL片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，TKR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

2）重叠延伸PCR：以上述获得的TKL和TKR片段为模板进行重叠延伸PCR，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的TK片段；

3）构建质粒pTK：将TK片段连入pBluescript II SK(+)质粒中，获得pTK质粒；

4）人工合成反向串联表达盒片段S，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，依次含有早期启动子P7.5、多克隆位点MCS 1、终止子SV40、反向多克隆位点MCS 2、晚期启动子P11；

5）构建质粒pTKS：表达盒片段S连入质粒pTK中，获得pTKS质粒；

6）PCR扩增VP3片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

7）构建载体pTKS-VP3-EGFP：将VP3片段、EGFP BGH pA片段分别插入pTKS质粒的多克隆位点MCS 1、反向多克隆位点MCS 2中，即可获得载体pTKS-VP3-EGFP，即为番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体，VP3片段序列如SEQ ID NO:5所示，EGFP BGH pA片段序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求2所述的一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于：步骤1）中扩增TKL片段和TKR片段的引物分别为：

TKL扩增引物

TKL-F：5'-tagggcgaattgGGTACCACGATGAAAAAACATTTGTC-3'（SEQ ID NO:7）；

TKL-R：5'-AAGTTAGACCCCGGGaattGCGGCCGCATTTAAATCTGCAGGTTCTTTTCCT CTTAGCGAT-3'（SEQ ID NO:8）；

TKR扩增引物

TKR-F：5’-GAAAAGAACCTGCAGATTTAAATGCGGCCGCaattCCCGGGGTCTAACTTA CAACACGGTC-3’ （SEQ ID NO:9）；

TKR –R：5’-gaacaaaagctgGAGCTCAATGCGTATTACTTCGCTTA-3’（SEQ ID NO:10）。

4.根据权利要求2所述的一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于：步骤2）中重叠延伸PCR的引物为：

TKL-F：5'-tagggcgaattgGGTACCACGATGAAAAAACATTTGTC-3'（SEQ ID NO:7）；

TKR –R：5’-gaacaaaagctgGAGCTCAATGCGTATTACTTCGCTTA-3’ （SEQ ID NO:10）。

5.根据权利要求2所述的一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于：步骤3）构建质粒pTK的具体过程为：将TK片段、pBluescript II SK(+)质粒分别用KpnI和SacI双酶切后，再进行连接反应获得质粒pTK。

6.根据权利要求2所述的一种番鸭细小病毒VP3基因重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于：步骤5）构建质粒pTKS的具体过程为：将表达盒片段S、pTK质粒分别用PstI、Not双酶切后，再进行连接反应获得质粒pTKS。