[发明专利]一种棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混合缓冲液、上游引物、下游引物、Taq酶和灭菌的ddH₂O，其特征在于所述上游引物为S-F：5’–AGGTAACGGCGTAAATAG–3’，所述下游引物S-R：5’–ACTTGCTTCAGGACCATA–3’。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液包含以下成份：

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液的量为1.0ml。

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μM/L。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，所述Taq酶为5U/μLTaq酶，其用量为0.5μL；所述灭菌的ddH₂O的用量为1.0mL。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，还包含阳性对照液和阴性对照液。

7.如权利要求1所述的检测试剂盒，所述阳性对照液为感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙的基因组DNA，所述阴性对照液为ddH₂O。

8.一种采用权利要求1-7任一所述的试剂盒检染棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的方法,包含以下步骤：

(1)棘腹蛙DNA的提取：

①取病蛙眼、口腔或胃部组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；

②加入1％-3％的β-巯基乙醇溶液，混匀后60-70℃水浴0.5-1h，每隔3-5分钟取出摇匀一次；

③10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀；

④向上清液中加入等体积的按体积比20-30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5-15min，取上清液至另一无菌离心管中；

⑤加入等体积的氯仿，混匀后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；

⑥向上清液中加入0.8-1.2倍体积的2-4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后于-18℃以下放置30min以上；

⑦10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；

⑧用70-80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，37℃消化20-40min，获得DNA之后于-20℃保存；

(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mLPCR反应管内分别加入2倍反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积20μL，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应；

(3)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存；

(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物放在含溴化乙锭0.5μg/mL的1％琼脂糖凝胶上，使用0.5×TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在226bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为金黄色葡萄球菌阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的金黄色葡萄球菌。