[发明专利]荧光成像自动聚焦系统和方法

说明书

技术领域

本公开涉及定量荧光成像，并且更具体地涉及使用角照明的自动聚焦系统和方法。

背景技术

荧光成像的最近改进是双远心宽视野荧光扫描器，该双远心宽视野荧光扫描器以独立于聚焦的行程间配准(pass-to-passregistration)实现准确的量化测量。出于所有目的以引用方式并入本文的于2014年6月23日提交的题为“远心宽视野荧光扫描系统和方法(Telecentric,Wide-FieldFluorescenceScanningSystemsandMethods)”的美国专利申请S/N14/312,409论述双远心宽视野荧光扫描系统的特征。该设计的一种特征是角照明(激发)，这具有减少的光学背景和因此的较高灵敏度的益处。然而，角照明的缺点是随着样本的高度改变，传感器上的所成像的线的位置也改变。因此，为了全面利用该角照明特征，重要的是追踪随着样本的高度改变，激发光在何处击中样本。

双远心扫描器可使用的另一特征是差分扫描成像技术，该技术用于通过将来自未照明区域的背景信号从检测自照明区域的信号减去来实现高图像性能。出于所有目的以引用方式并入本文的于2011年4月11日提交的题为“差分扫描成像系统和方法(DifferentialScanImagingSystemsandMethods)”的美国专利申请S/N13/084,37论述适用的差分扫描成像技术。当结合角照明使用这些技术时，希望荧光样本的z高度相对于扫描器系统是恒定的。如果样本高度改变，那么来自照明区域的所检测的信号跨越检测阵列“离开”，且因此所测量的信号的量不准确。因此，在给定的固定检测器阵列处于适当位置中的情况下，重要的是在收集实际成像数据之前校正样本高度改变。

奥尔森等人(美国专利7518652、7646495和7893988，所述专利各自以引用方式并入本文中)设计在从显微镜载物片上的试样捕捉图像数据之前且在此期间将线扫描相机聚焦的方式。所采取的做法由在扫描载物片之前计算聚焦信息组成。该聚焦信息是在点聚焦或带聚焦程序中获得的。在点聚焦状况下，线扫描相机系统首先将载物片定位在所要的测量位置处，将物镜移动通过一组预定高度值，且在每一高度处获取图像数据，且接着确定最大对比度的高度(z轴设置)，该最大对比度的高度进而被确立为最佳聚焦高度。在带聚焦程序的情况下，随着载物片处于扫描运动中，物镜以正弦方式连续移动。分析图像数据，且最大对比度的高度确定最佳聚焦z高度。两种程序的不同之处在于在图像获取期间，物镜的垂直运动如何与载物片的水平运动同步。可被描述为“停走”方法的第一方法是缓慢的，这是因为由于停走过程，存在相当多的开销时间。带聚焦方法更快，但针对15mmx15mm的扫描区域，仍花费超过1分钟。

针对显微成像而设计奥尔森的方法，其中照明光穿过显微镜物镜，即，相对于成像路径是同轴的或不成角度的。这意味随着物镜与样本之间的垂直距离改变(z轴)，在x-y平面中的成像传感器上的位置不改变——仅图像对比度改变。在该显微镜构造中，将物镜位置调整到不同高度位置且寻找图像具有最高对比度的最佳位置是有意义的。然而，在角照明的状况下，成像传感器上的x-y位置不随着聚焦改变而改变。这意味在可实施寻找最佳聚焦的奥尔森的“停走”过程之前，将需要用于寻找x-y位置的额外步骤。针对带聚焦方法，将需要一组更精细的步骤。这进一步增加了复杂性且减慢了过程。

此外，奥尔森的技术没有提供由于样本的z高度改变而在检测器上离开的所检测的信号。因此，在不同高度处获得图像的理念不起作用，这是因为，在许多z高度处，将不存在供检测的信号(离开了检测器)且因此任何基于对比度的方案将不能检测最佳聚焦处于何处。因此，必须首先使样本高度接近给出最佳聚焦的标称高度，因此可(例如)使用差分扫描成像技术来正确地测量最佳聚焦。

因此，仍需要较稳健的、定量的、快速的宏观荧光成像器，其不具有对光在视野中来自何处的角依赖性的限制。此外，仍需要准确地维持在样本上荧光光的原点的相对位置，以使得多行程图像被准确地对准，且因此消除存在于当前宏观宽视野成像器中的依赖于聚焦的位置移位。

发明内容

本公开涉及定量荧光成像，且更具体地涉及使用角照明来获得自动聚焦信息的宽视野荧光成像系统和方法。

本发明的实施例结合检测器阵列，诸如结合双远心扫描器，使用以角照明进行的激光扫描(例如，点扫描或线扫描)，这有利地克服与先前自动聚焦方案相关联的难点和缺陷。本发明的实施例提供显著较快且较简单的过程来追踪角照明光与样本(例如荧光样本)相交的高度位置。