[发明专利]对水产养殖环境沉积物中反硝化微生物的定量方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种对水产养殖环境沉积物中的反硝化微生物进行实时荧光定量PCR检测的方法，属于环境微生物生态学技术领域，该技术用于测定水产养殖沉积物中反硝化微生物的数量。

技术背景：

我国是世界第一的水产养殖大国和水产品贸易大国，2012年水产品总量就达到了5907.68万吨，约占全球总量的38％，连续24年位居世界首位。为了提高单位产量，养殖过程中往往过量投入肥料、饵料等，导致养殖环境中残饵、动物排泄物及尸体不断堆积，碳、氮、磷的含量超标，富营养化程度严重，养殖生物频繁发生病害或死亡。这不但降低了养殖业的产量和质量，还污染了养殖环境，并随着养殖环境废水的排放影响到周边环境。对养殖生物和环境的危害最大的物质是含氮化合物，如氨氮、亚硝酸根、硝酸根等，有效去除含氮污染物是保证水产养殖业可持续发展的前提。

在氮素循环中，消除氮污染、降低富营养化主要依赖反硝化过程。反硝化过程大致可分为四步：NO₃^-→NO₂^-→NO→NO₂→N₂，这四步都由反硝化微生物进行。反硝化微生物是一类能够把硝态氮(NO₃^--N)转化为气态氮(N₂)的微生物群落，地理分布比较广泛，在土壤、海洋、河口、湖泊等自然环境和废水处理厂、堆肥、生物反应器等人工环境中都有发现。在系统发育上，具有很高的多样性，分属于假单胞菌属(Pseudomonaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)等多个属；在营养方式上，分为异养型和自养型，大部分属于异养型，有一些只利用一种碳源，还有一些能够利用氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)或其他物质进行自养生长；在需氧情况上，分为好氧型和厌氧型，之前一直认为反硝化微生物参与反硝化作用需要在厌氧的条件下，随着研究的进一步开展，好氧反硝化微生物也不断被发现。现阶段对反硝化微生物的数量测定技术水平有限，传统的富集培养方法仅能得到环境中小于1％的微生物，无法用于对反硝化微生物的研究和定量。分子生态学上常用的16SrRNA基因，由于反硝化微生物系统发育广泛的多样性，也无法设计特异性引物，用来研究和检测其群落组成、分布和数量。

在反硝化过程的四个步骤中，由亚硝酸盐(NO₂^-)转化为一氧化氮(NO)的过程，是反硝化作用有别于其它硝酸盐代谢的标志性反应，是反硝化过程中最重要的限速步骤，亚硝酸盐还原型反硝化微生物也被作为代表性种类，被广泛用于反硝化微生物种群组成和数量的研究。亚硝酸盐还原酶(Nir)是催化此反应的限速酶，可作为分子标记对反硝化微生物进行定量研究。亚硝酸盐还原酶存在于细胞周质中，有两种类型，一种是可溶性含铜酶(Cu-Nir)，含有Cu催化中心，称为Cu型亚硝酸盐还原酶，由nirK基因编码；另一种是细胞色素还原酶(cd1-Nir)，含有细胞色素c和d1，称为Cytcd1型亚硝酸盐还原酶，由nirS基因编码。两种酶功能相同，但结构和催化位点不同，而且不能共存于同种细胞中。在同一环境中，含有两种Nir酶的微生物同时存在。