[发明专利]一种毛细管内检测酶动力学的方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种毛细管内检测酶动力学的方法。

背景技术

检测酶动力学的常用方法有分光光度法、荧光法和放射性核素法等，但这些方法操作繁琐、耗费的样品多，而生物体内的酶含量往往都是微量的，所以传统方法对酶动力学等方面的检测有很大的局限性。

量子点(QDs)作为一种新型荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、颜色可调、抗光漂白和荧光寿命长等优点。将量子点与荧光多肽结合，当它们之间的距离小于半径时，会发生非辐射能量转移，即荧光能量共振转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)。从而，通过荧光检测，可以分析彼此之间的相互作用。

目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的CdSe/ZnS量子点。因此，可通过亲水性配体交换、两亲性配体封装、硅烷涂层等方法将脂溶性量子点转换为水溶性量子点。水溶性量子点可与蛋白通过共价偶联或静电吸附的方法制备量子点荧光探针。

另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。且毛细管内的方法可实时检测生物分子微量的变化，比普通的毛细管外的方法更灵敏、便捷、迅速。现有技术中尚无良好的检测酶动力学的方法。

本方法通过制备量子点生物探针，并在其中多肽序列插入了一个酶切位点“LVPRGS”，分别改变酶进样时间，即与量子点生物探针反应不同的时间，测定并计算其荧光毛细管电泳中电泳峰面积之比，绘制峰面积之比与反应时间的曲线，从而实现酶动力学的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术中尚无良好检测酶动力学的方法的不足，提供一种毛细管内检测酶动力学的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为，一种毛细管内检测酶动力学的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将量子点与荧光标记的多肽在毛细管外混合反应，得到量子点生物探针；

(2)荧光毛细管电泳检测：将酶与量子点生物探针在毛细管内相互作用，通过荧光检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比与反应时间的关系，绘制峰面积比-时间的标准曲线。

进一步地，所述的酶与量子点生物探针在毛细管内的进样顺序为先进电泳速度慢的酶，再进电泳速度快的量子点生物探针。

作为优选，所述的量子点生物探针中，多肽C端具有一个六聚组氨酸序列偶联QDs，N端偶联荧光染料，以及具有一个酶切位点“LVPRGS”，QDs与荧光染料之间能产生FRET。

进一步地，所述的量子点为含有Zn的量子点。

作为优选，所述的量子点为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe

本发明所取得的有益效果是，本发明提供的可用于检测酶动力学的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。

附图说明

图1：不同进样时间的酶在毛细管内酶切电泳图(a)ATTO590-H6-QDs(b)10s(c)20s(d)40s(e)80s(酶浓度1U/mL，QDs：ATTO590-H6＝1：32，毛细管外混合1min组成量子点生物探针，量子点生物探针进样10s，间隔20s，实线，565nm，QDs供体检测通道；虚线，625nm，ATTO590受体检测通道)。

图2：S₆₂₅/S₅₆₅的值与反应时间的关系。

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。

实施例1

ATTO590-H6-QD检测凝血酶动力学变化

量子点生物探针由荧光染料“ATTO590”，量子点“CdSe/ZnSQDs565nm”，多肽“DDDLVPRGSGP₉G₂H₆”组成。

1、脂溶性QDs经GSH转换为水溶性QDs