[发明专利]一种茶树DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茶树DNA的提取方法。

背景技术

茶树（Camelliasinensis（L.）O.Kuntze）属山茶科山茶属茶亚属茶种植物，起源于我国西南地区，经长期的引种、传播，我国茶树生长区域从N18°30′-35°13′，E94°-122°，南至热带边缘，北至暖温带。我国是茶树的主要原产地，至今已有3000多年的人工栽培历史，经过几千年的人工或自然育种，形成了非常丰富的茶树种质资源。

DNA分子标记技术是研究茶树起源、分子演化、遗传多样性、品种鉴定的一个重要工具。目前常见的茶树DNA提取方法主要是CTAB法和SDS法，这两种方法已有很多研究，也有很多优化方案。由于茶树组织中含有大量的多糖多酚，而多糖多酚又容易与DNA结合，所以茶树DNA的提取一直没有理想的方法。而通过对已有的优化方法进行重复发现：若要提取高纯度的DNA则单样提取周期长，反之，若缩短提取时间，所提的DNA纯度较低。试剂盒法提取茶树DNA，虽然提取纯度高，但因膜过滤使提取量降低。所以，如何提供一种获取的DNA浓度高、提取时间短的茶树DNA的提取方法是目前急需解决的一个难题。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种获取的DNA浓度高、提取时间短的茶树DNA的提取方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种茶树DNA的提取方法，具体步骤如下：

（1）取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状；

（2）将步骤（1）的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后，加入650μL水浴的提取液，所述的提取液由pH8.0；100mmol/L的Tris-盐酸、pH8.0；20mmol/L的EDTA、1.0mol/L的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成，漩涡震荡充分混匀后，再加入15μL的β-巯基乙醇，60℃-70℃，水浴15-25min，每隔5min混匀一次，得到粗样品；

（3）水浴结束后加入10μL，10mg/mL的RNase-A混匀后，40℃水浴5min，得到粗样品；

（4）取出离心管先后加入PH8.0；400μL的Tris平衡酚和400μL氯仿/异戊醇，漩涡震荡充分混匀后10000rpm离心10min，获得上清液；

（5）将步骤（4）的上清液移至一个新的2mL的离心管中，加入3倍上清液体积的-20℃预冷无水乙醇，混匀，此时有DNA析出，倒去上清液，后再用1ml-20℃预冷无水乙醇清洗一次，倒去上清液；

（6）将步骤（5）得到的沉淀物中加入45℃预热的去离子水，再放入45℃水浴锅中溶解，重复步骤（5）的操作一至两次，10000rpm离心1min后，去上清后再次空转10000rpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇，待沉淀微白时取出，加入200μL去离子水后获得DNA，后将提取的DNA放置-20℃冰箱中备用。

优选地，步骤（2）中CTAB/SDS的体积比为1：6。

优选地，步骤（4）中氯仿/异戊醇的体积比为24：1。

本发明的有益效果在于：

1、提取的茶树叶片的基因组DNA浓度高。

2、提取时间短，在1-2小时内可以完成，且所用试剂价格便宜，降低了成本。通过反复实验验证，在提取试剂中加入可以结合多酚的试剂，同时简化操作步骤。使提取的DNA的质量与含量都较高的同时将提取单个样品的时间控制在100min以内，大大节省了操作的时间，由于提取试剂可以自行配制降低实验的成本。

附图说明

图1是本发明提取的茶树DNA的电泳图；

图2是本发明提取的茶树DNA进行PCR扩增的电泳图。

具体实施方式

茶树DNA的提取方法，具体步骤如下：

（1）取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状；

（2）将步骤（1）的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后，加入650μL水浴的提取液，所述的提取液由pH8.0；100mmol/L的Tris-盐酸、pH8.0；20mmol/L的EDTA、1.0mol/L的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成，漩涡震荡充分混匀后，再加入15μL的β-巯基乙醇，60℃-70℃，水浴15-25min，每隔5min混匀一次，得到粗样品；