[发明专利]大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体及其制备方法

说明书

本发明提供一种大肠杆菌2‑脱氧‑D‑核糖‑5‑磷酸醛缩酶突变体及其制备方法，本发明通过易错PCR构建DERA酶的随机突变体文库，然后进行酶活测定筛选酶活力最高的突变株。经酶活力测定，本发明提供的大肠杆菌DERA突变体较野生型DERA酶活可提高3.8个活力单位。通过对含有编码所述DERA突变体的基因的大肠杆菌工程菌进行大规模发酵，可实现大肠杆菌DERA突变体的批量生产。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体及其制备方法。

背景技术

大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)，编号为EC4.1.2.4，能够催化5-磷酸-2-脱氧-D-核糖分解成3-磷酸-D-甘油醛和乙醛，并可催化其逆反应。

易错PCR是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。

通过易错PCR法获得酶活力更高的DERA突变体成为一种改造DERA酶的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)突变体及其制备方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体，其为：1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或2)SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。

本发明还提供编码所述DERA突变体酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有编码所述DERA突变体酶的基因的载体、宿主细胞和转基因工程菌。

本发明还提供含有编码所述DERA突变体酶的基因的大肠杆菌工程菌。

本发明进一步提供所述DERA突变体酶的制备方法，将含有编码所述DERA突变体酶的基因的大肠杆菌工程菌接种于LB培养基中，37℃，180rpm培养8-10h，按3％的接种量接种于盛有3L发酵培养基的发酵罐中，发酵罐容积为5L，在37±1℃，300rpm，空气流量4L/min的条件下培养8-10h后，添加60％甘油作为补料，当OD600达到30时，降温至30℃，添加0.1mMIPTG进行诱导，诱导10h后，放罐，离心发酵液，收集菌体，加入3倍体积pH7.5的50mM碳酸氢钠缓冲液，冰水浴超声破碎，8000rpm离心取上清，即得含有所述DERA突变体的粗酶液。

所述发酵培养基为：甘油4g/L，磷酸氢二钾12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵0.5g/L，氯化钙0.0152g/L，氯化镁0.41g/L。

经酶活力测定，本发明提供的大肠杆菌DERA突变体酶较野生型DERA酶活可提高3.8个活力单位。通过对含有编码所述DERA突变体的基因的大肠杆菌工程菌进行大规模发酵，可实现大肠杆菌DERA突变体酶的批量生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR扩增DERA基因的电泳检测结果；其中，M为DNA Marker，1和2为目的DERA基因。

图2为本发明实施例1中质粒pET-DERA的酶切电泳图；其中，M为DNA Marker，1为酶切后的pET-DERA。

图3为本发明实施例3中DERA突变体的SDS-PAGE电泳检测图；其中，M为蛋白Marker，1为细菌裂解液。

图4为本发明实施例4中DERA酶活力测定原理示意图。