[发明专利]人AQP10和SOX17基因甲基化位点的检测和应用

说明书

本发明公开了肝癌相关的人AQP10基因和SOX17基因的甲基化位点及应用，特点是利用一种焦磷酸测序法定量检测人AQP10基因特异性位点cg20713492和SOX17基因位点cg02919422的甲基化水平，设计了针对两位点的上、下游PCR扩增引物和焦磷酸测序引物，其中一条扩增引物带生物素标记。本发明在原发性肝细胞癌患者中筛查AQP10基因和SOX17基因的特异性位点，能对其甲基化水平进行快速准确的定量检测。

技术领域

本研究涉及人AQP10(aquaporin 10，水通道蛋白10)基因和SOX17(SRY(sexdetermining region Y)-box 17，性别决定区Y框蛋白17)基因特异性DNA(脱氧核糖核酸)甲基化位点在肝癌中的甲基化定量信息的改变，具体是指应用焦磷酸测序技术发现AQP10基因特异性DNA甲基化位点(cg20713492)在肝癌中甲基化程度降低；SOX17基因特异性DNA甲基化位点(cg02919422)在肝癌中甲基化程度升高。这些为探索肝癌的发病机理，找到与诊断或治疗相关的潜在标志物提供支持。

背景技术

肝细胞癌是世界范围内的发病率为第六位的恶性肿瘤，而其致死率却高达第三位。肝细胞癌的危险因素包括酗酒、肝炎病毒感染、黄曲霉素摄入以及环境污染等。但由于致病因素复杂、发病机制不明，肝细胞癌的诊断和治疗都面临巨大的挑战。近年来的众多研究表明，表观遗传因素在肝癌的发生发展中起到重要作用。DNA甲基化作为主要的表观调控机制，是指DNA分子CpG二核苷酸上胞嘧啶环的5’碳原子由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine)作为甲基供体产生的一种可逆的共价修饰。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

AQP10基因位于1号染色体长臂2区1带，是水通道家族(Aquaporin，AQP)中的成员，编码蛋白位于细胞膜上，是上皮细胞吸收和排泄水、甘油、尿素等中性溶质的通道，与物质转运和代谢息息相关。AQP10在十二指肠、空肠、回肠大量表达，促进水和甘油的吸收。甘油是重新合成三酰基甘油和葡萄糖重要底物，作为控制甘油进出细胞的调节器，水通道蛋白家族的失调与代谢性疾病关系密切，如肥胖症、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝病，而后者为肝癌 的风险因素之一。目前对AQP10的研究鲜有涉及肿瘤领域，Martens JH等人发现全反式维甲酸处理的急性早幼粒白血病细胞NB4细胞株中，AQP10蛋白表达上调，可能涉及组蛋白乙酰化的表观遗传学过程。

SOX17基因位于8号染色体长臂12区23带，已知参与胚胎发育调节，通过转录调控抑制Wnt信号通路。研究表明SOX17基因的广泛甲基化在大肠腺瘤到癌的恶变过程中显著增加；在乳腺癌血清中SOX17基因启动子区甲基化提示不良预后。此外，SOX17通过影响性腺发育，导致生殖细胞成熟障碍，被认是生殖细胞癌的候选诊断标志物。目前未见该基因在肝癌中的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测人AQP10基因和SOX17基因特异性位点的甲基化水平及特异性引物，利用该引物可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平。

焦磷酸测序法定量检测人AQP10基因和SOX17基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR(聚合酶链式反应)引物和甲基化测序引物。其中，所述AQP10基因的PCR上游引物序列为：biotin-5′-ATTTGTTAGGATGGGGGAGGTTAG-3′，下游引物序列为：5′-TCCCTCTATCTACATAAACACACTATCAC-3′，甲基化测序引物序列为：5′-CTTTAAAACCATTAACTCAATTC-3′；SOX17基因的PCR上游引物序列为：5′-GTTATTAGGTAGGTTGGGGGTTT-3′，下游引物序列为：biotin-5′-ACCTACCCCCCTCCCCTCAA-3′，甲基化测序引物序列为：5′-TTTGGGTAAGTTGTAGATTAGAT-3′。