[发明专利]一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1 gp41重组抗原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法。

背景技术

HIV抗体诊断试剂作为目前初步诊断HIV的主要方法，具有巨大的市场价值。随着生物技术的发展，利用基因工程的手段，制备具有良好免疫反应性的HIV-1gp41重组抗原原料，对于HIV抗体诊断试剂的发展有着深远意义。

目前市场上所用的HIV-1gp41重组抗原主要从国外进口且价格昂贵，主要是由于HIV-1gp41是一种膜蛋白，本身的毒性使其在大肠杆菌体内难以可溶性表达。目前市场上所用的gp41抗原蛋白均是截取了全长蛋白的部分优势表位并添加融合标签来表达，此方法虽然能解决蛋白在胞内表达的问题，但是重组抗原通常以包涵体形式出现，而包涵体的复性存在困难且复兴率较低。除此之外，截短的重组抗原只含有天然抗原的部分片段，却增加了一段融合蛋白序列，这势必会使重组抗原和天然抗原在构象上存在一定的差异，从而影响其免疫反应性。具有全长序列的HIV-1型gp41重组抗原，因其包含了天然gp41抗原所含有的全部氨基酸序列，在结构上比截短融合表达的gp41重组抗原更具完整性，使其在HIV快速检测领域的应用将具有更大的潜力。

无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。相对于体内表达体系，大肠杆菌无细胞体系可以很好的解决膜蛋白表达引起的细胞毒性问题。本专利合成了经密码子优化的HIV-1gp41全长基因，通过构建pIVEX2.4c-gp41无细胞表达载体，在大肠杆菌无细胞反应体系中添加去污剂，实现了全长HIV-1gp41的可溶表达，亲和纯化获得的目标蛋白经制备乳胶HIV抗体诊断试纸评估具有免疫反应性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法，包括以下步骤：

(1)合成HIV-1gp41重组抗原全长基因，所述HIV-1gp41重组抗原全长基因的基因序列如序列SEQIDNO.1所示；

(2)将HIV-1gp41重组抗原全长基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组载体pIVEX2.4c-gp41；

(3)将步骤(2)得到的重组载体pIVEX2.4c-gp41放到大肠杆菌无细胞体系中表达，同时在体系中添加去污剂，所述去污剂为Brij78或Brij58，在大肠杆菌无细胞体系中的质量体积分数为5g/L；

(4)利用亲和层析纯化分离，得到HIV-1gp41重组蛋白。

本发明的有益效果是：因HIV-1gp41重组蛋白的高疏水性会对大肠杆菌细胞产生的毒害作用，导致HIV-1gp41重组蛋白在大肠杆菌体内难以表达，利用大肠杆菌无细胞体系开放性的特点可有效避免目标蛋白对宿主细胞的损害；通过向大肠杆菌无细胞体系中添加去污剂，提高目标蛋白的可溶性表达效率，利用pIVEX2.4c-gp41所带的6his亲和标签，可以高效的利用亲和层析纯化HIV-1gp41重组蛋白，此方法对高效制备具有良好免疫反应性的系列HIV重组抗原具有重要的意义。

附图说明

图1：重组载体pIVEX2.4c-gp41结构示意图；

图2：无细胞表达体系中添加去污剂后可溶蛋白的电泳图，其中，Lane1,蛋白marker；Lane2,对照组；Lane3,1％Tween80；Lane4,0.2％TritonX-100；Lane5,0.75％β-OG；Lane6,0.1％DDM；Lane7,0.5％Brij78；Lane8,0.5％Brij58；

图3：无细胞表达体系中添加去污剂后不溶蛋白的电泳图，其中，Lane1,蛋白marker；Lane2,对照组；Lane3,1％Tween80；Lane4,0.2％TritonX-100；Lane5,0.75％β-OG；Lane6,0.1％DDM；Lane7,0.5％Brij78；Lane8,0.5％Brij58。

具体实施方式