[发明专利]一种双通道结构光照明超分辨成像方法与装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种双通道结构光照明超分辨成像方法与装置。

背景技术

脂筏在细胞质膜上信号传导中起重要作用，利用荧光显微成像技术直接观察脂筏微结构及其相应细胞功能具有重要意义。由于传统荧光显微镜的分辨率存在衍射极限，无法对脂筏进行检测。近年来发展的一些超分辨成像技术，如受激辐射耗损显微术(STED)、光激活定位显微术(PALM)等最近也开始被用于脂筏研究，然而，它们都只是被用于探测脂筏簇，而无法检测脂筏周围的物理环境。近来发展的一些可通过其发射光谱的变化来反映所处物理环境的环境敏感探针。这类探针需要使用双荧光探测通道同时探测，并结合发射光谱平移来确定和区分细胞膜上液态有序相与无序相。目前，这类探针都只局限于在传统型的双通道荧光显微镜上进行探测，所获得图像的空间分辨率受衍射极限限制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明方案提出了一种单光源激发的双通道同时探测的结构光照明超越衍射极限空间分辨率的显微成像方法与装置。利用本方案，可以在亚衍射分辨率尺度实现细胞膜上脂筏多相性的检测。

本发明的第一具体实施方案是：一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，包括光源及用于控制光路方向的沿光传输方向依次设置的第Ⅰ反射镜、第Ⅰ透镜、光阑、第Ⅱ透镜及位于第Ⅱ透镜后侧的能改变结构光照明方向的空间光调制器；

沿所述空间光调制器导出光路方向依次设有第Ⅲ透镜、挡光板、第Ⅳ透镜，所述光调制器导出的光经第Ⅲ透镜受到挡光板阻挡形成仅允许+1级衍射光和-1级光通过的光路；

所述第Ⅳ透镜导出光经一荧光显微镜传输至第Ⅱ二色镜，所述第Ⅱ二色镜光的导出方向分别设置有第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器，所述第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器与第Ⅱ二色镜光之间设有带通滤光片。

进一步的，所述入射到空间光调制器的光入射角度＜10°。

进一步的，所述荧光显微镜包括物镜、样品台以及用于接收第Ⅳ透镜导入光的第Ⅴ透镜，所述第Ⅴ透镜后侧设有接收第Ⅴ透镜导入光并向物镜导入光源及接收样品出射的经物镜导出光的第Ⅰ二色镜，所述第Ⅰ二色镜导出光经第Ⅵ透镜导向所述第Ⅱ二色镜。

进一步的，所述光源为激光器。

本发明的第二具体实施方案是：利用上述的一种双通道结构光照明超分辨显微成像装置的双通道结构光照明超分辨成像方法，包括以下步骤：

（1）采集相关荧光图像

步骤S1：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为0时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；

步骤S2：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，利用第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；

步骤S3：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为90°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像；

步骤S4：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为0时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像。

步骤S5：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像。

步骤S6：空间光调制器的相位控制图像设置为光照方向为0°、相位为时，第Ⅰ探测器和第Ⅱ探测器采集荧光图像。

（2）重构超分辨率图像步骤：

步骤S1：对图像采集步骤（1）中第Ⅰ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；

步骤S2：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；

步骤S3：由各方向的三个相位图像对应频谱信息，求解3×3的线性方程组，分离出0级，+1级和-1级频谱成像信息；

步骤S4：由分离出0级与+1级或-1级频谱的重叠区域的信息确定结构光照明的空间频率k0与初始相位；

步骤S5：将分离出的+1级频谱平移+k0，将分离出的和-1级频谱平移-k0；

步骤S6：将平移后的+1级和-1级频谱与0级频谱叠加合成，并做维纳滤波，使得其频谱扩宽；

步骤S7：对上一步骤得到的扩宽的频谱做傅里叶反变换，获得第Ⅰ探测器采集的超分辨图像。

步骤S8：对图像采集步骤（1）中第Ⅱ探测器采集到的6张原始图像进行图像亮度均一化处理以消除由于光源强度波动引起的成像亮度的影响；

步骤S9：对上述图像进行傅里叶变换操作，获得相应的频谱信息；