[发明专利]可溶性埃博拉病毒包膜蛋白疫苗的制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于病毒疫苗制备技术和医学生物技术研究领域。本发明涉及重组的埃博拉病毒包膜蛋白（GP蛋白）的序列组成及其在疾病预防中的使用。

背景技术

埃博拉病毒（Ebolavirus）是引起人类和灵长类动物发生埃博拉出血热的致病病毒，它是当今世界上最致命的出血热病毒，感染者症状为恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、发热等，其致死率达50～70％，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量休克或多发性器官衰竭。自1976年首次被发现以来，埃博拉出血热已多次在非洲多个国家和地区暴发流行，造成严重的公共卫生事件。2013年起，埃博拉病毒感染病例相继出现在几内亚、利比里亚、塞拉利昂等西非国家，且以惊人的速度传播。截至2014年12月15日，世界卫生组织宣布埃博拉病毒已在全球范围内造成6841人死亡，受感染的病例总数达到18464人，成为有史以来最大的一次埃博拉疫情。尽管埃博拉属于地区局域性流行病，但是各国都将它做为头号防御对象，一旦传入该国，会影响到该国与其它国家的经贸往来和旅游。埃博拉在任何地方大范围传播，都会酿成一场人道灾难，即使只有少数病例，也会在这个严重依赖贸易的地区引发经济动荡。

疫苗是预防埃博拉病毒的最好策略。2015年1月欧盟投入逾2亿欧元推动埃博拉疫苗研究。埃博拉病毒具有一个独特和唯一的包膜蛋白（envelopeglycoprotein，GP），这个GP蛋白具有免疫原性，免疫小鼠后能够产生抗体中和埃博拉病毒。目前研发的各种埃博拉病毒疫苗均是针对GP蛋白的。

目前，进入临床试验的埃博拉病毒疫苗主要有两种：一种是减毒水疱性口炎病毒载体的埃博拉疫苗“rVSVΔG-EBOVGP”，另一种复制缺陷型3型腺病毒载体的埃博拉疫苗“cAd3-EBOV”。这两种疫苗均为活的病毒疫苗，注射人体后，通过疫苗所表达的GP蛋白来激活人体的免疫系统，从而产生中和埃博拉病毒的抗体。

然而，以病毒为载体的疫苗在注射人体后，会产生一过性发热和肌肉疼痛等不适症状。瑞士日内瓦大学医院2014年12月11日宣布暂停试验德国默克公司(Merck)和美国纽琳公司(NewLink)联手研发的埃博拉疫苗，源于4名接种疫苗的志愿者出现了关节疼痛症状。

能否用单纯的GP蛋白来制备疫苗？这在目前的技术上存在一定的难度。这是因为GP蛋白在胞内先是翻译成完整的676个氨基酸大蛋白，随后被胞内furin酶于501位氨基酸后切割成两个蛋白：GP1和GP2。GP2蛋白为穿膜蛋白，锚定在细胞膜上，而GP1蛋白通过二硫键与GP2蛋白相链接形成复合体。同时，三个GP1/GP2蛋白复合体相互结合形成trimer，构成了埃博拉病毒包膜上的刺突结构。因此，从上可以看出，GP蛋白为非分泌性蛋白，结构复杂，需依赖于细胞膜才能正确组装。

发明内容

本发明是在埃博拉病毒包膜蛋白第629位氨基酸后插入两个凝血酶切割位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser（LVPRGS），即在第629位氨基酸后插入的序列具体为GSGLVPRGSGLVPRGS，重组后的埃博拉病毒包膜蛋白完整的氨基酸数目为692个(SEQIDNO：1)，完整的重组蛋白的具体序列为：

MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSST60

NQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSE120

CLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGV180

VAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLT240

YVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRK300

IRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREA360

AVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDT420

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