[发明专利]家蝇胚胎细胞构建抗菌肽attacin真核表达系统所表达的产物及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术，为杆状病毒表达载体系统提供候选昆虫细胞系，尤其涉及家蝇胚胎细胞构建抗菌肽attacin真核表达系统所表达的产物及构建方法。

背景技术

家蝇作为最常见的昆虫，长期生活在肮脏的环境而自身不被感染，是研究昆虫抗菌肽最好的材料之一。目前从家蝇体内分离的天然抗菌肽attacin具有广谱抗菌作用，具有较强的抗菌活性。由于昆虫抗菌肽提取、纯化困难，化学合成昂贵，且不易标准化，无法规模生产是制约其进入实际应用的最大障碍。因此，通过基因工程技术规模生产为理想手段。基因工程生产抗菌肽，稳定、高效的表达系统是关键。由于抗菌肽本身具有抗菌活性，对宿主菌有杀伤作用，因而目前抗菌肽在原核中表达多采用融合表达方式。原核系统操作简便，但表达的蛋白往往不能有效正确的翻译，使得选择真核表达系统成为目前抗菌肽基因工程研究的热点。

昆虫杆状病毒表达载体系统（Baculovirusexpressionvectorsystem,BEVS)具有安全性高、基因克隆容量大、具有完备的翻译后加工修饰系统、高效表达外源基因、无内毒素污染等优点，利用昆虫杆状病毒表达系统表达的外源蛋白，其功能和结构与天然蛋白相似，是实现大规模低成本生产基因工程产品的有效手段。目前用于BEVS的细胞系主要有3个，商品化的BEVS主要使用草地贪夜蛾卵巢组织的Sf21细胞系和其衍生株Sf9。与病毒表达载体的研发和细胞生长培养基的商品化相比，杆状病毒表达载体系统中昆虫细胞系的建立和改进稍显落后。近年来从鳞翅目昆虫建立的一些新的细胞系，但尚未发现在蛋白表达方面表现优秀的细胞系。

本发明以家蝇抗菌肽attacin为目标基因，制备重组杆状病毒Bacmid-pFastBac^TM-attacin转染自行建立的家蝇胚胎细胞系,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统。本发明为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用于抗菌肽的基因工程生产奠定基础，也为杆状病毒表达载体系统提供候选昆虫细胞系。

发明内容

本发明以家蝇抗菌肽attacin为目标基因，全基因合成家蝇抗菌肽attacin，制备重组杆状病毒BacmidDNA（Bacmid-pFastBac^TM-attacin）转染自行建立的家蝇胚胎细胞系MDEC-07114,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统，提取家蝇胚胎细胞培养上清和细胞裂解物粗蛋白，经镍柱纯化，SDS-PAGE和Western-Blot对蛋白表达情况进行检测、鉴定，并对表达产物进行抗菌活性检测。本发明成功构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统，表达产物具有生物学活性，为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用于抗菌肽的基因工程生产奠定基础，也为自建昆虫细胞系作为杆状病毒表达载体系统候选昆虫细胞等进一步推广应用提供方向。

制备步骤及方法：

1.1细胞和质粒

家蝇胚胎细胞系（MDEC-07114）、重组杆状病毒Bacmid-pFastBacTM-attacin由本寄生虫教研室自行建立和保存；

1.2主要实验试剂

金普诺安昆虫细胞培养基（GPM-115）（金普诺安蛋白质工程技术有限公司）；Cellfectin转染试剂（美国Invitrogen公司）；一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒（上海生工）、Ni-NTASefinoseTMResinKit（上海生工）、UNIQ-200柱式质粒中量抽提试剂盒（上海生工）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程研究所制品）；蛋白Marker（购自大连TaKaRa公司）；BCA蛋白定量试剂盒、考马斯亮蓝R-250、羊抗鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP标记二抗（碧云天生物技术研究所）；Anti-His（Abcam）；GAPDH(Fermentas);NC膜、发光液(美国millipore公司)；吐温-20（美国Amresco公司）；显影粉、定影粉（上海冠龙公司）；大肠埃希菌44113由课题组自行保存。

1.3方法

1.3.1attacin基因合成

根据Genbank登录号AY460106的序列号委托上海生工生物工程有限公司合成，基因全长627bp。

1.3.2家蝇抗菌肽attacin重组杆状病毒表达载体的构建及鉴定

1.3.2.1attacin基因的合成