[发明专利]一种建立胰腺癌模型的方法

说明书

本发明涉及一种建立胰腺癌模型的方法，属动物模型建立技术领域。该方法根据TCGA数据库人类胰腺癌中变异率最高的癌基因和抑癌基因，构建过表达一个癌基因、同时敲降两个抑癌基因的慢病毒，在树鼩胰腺头部原位注射此慢病毒，以诱导树鼩胰腺肿瘤；其具体步骤包括：(1)、慢病毒载体的构建；(2)、病毒包装、滴度测定及体外验证；(3)、病毒注射；(4)、树鼩的监测和病理鉴定。本发明的优点在于：诱发周期短、发病率高且稳定、操作简单方便；能够快速高效的建立能最大程度模拟人类胰腺癌的遗传机理的树鼩胰腺癌模型，能用于研究人类胰腺癌的发病机制、发掘肿瘤治疗靶点及开发新的抗肿瘤药物，为人类胰腺癌的治疗提供参考。

技术领域：

本发明属于动物模型的建立方法，具体涉及利用慢病毒介导癌基因的过表达及抑癌基因的敲降以诱导树鼩胰腺癌模型的方法。

背景技术：

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来明显上升，5年生存率<5％，是预后最差的恶性肿瘤之一。研究胰腺癌的发生发展机制、寻找有效的检测及治疗手段是非常重要的，而肿瘤动物模型是研究肿瘤发生发展机制、探索新的治疗靶点、新的治疗手段及药物开发的重要工具之一。

目前，有关胰腺癌的动物研究主要在以啮齿类动物建立的胰腺癌模型上进行，但是啮齿类与人类的物种差异性较大，不能很好地模拟人类疾病；随着树鼩基因组测序完成，以及部分蛋白组学的研究提示树鼩与灵长类亲缘关系最为接近，这为树鼩作为一种新型实验动物模型，在人类重大疾病研究领域部分替代非人灵长类动物提供了重要依据。

现有的胰腺癌动物模型主要包括：基因工程鼠模型、裸鼠移植瘤模型、化学致癌剂诱导模型等；这些模型存在一定的缺陷性：不能很好地模拟人类疾病的发病机理、诱发周期长、诱发率低等。近年来，慢病毒技术由于具有感染物种局限性小、分裂期和静止期细胞均可有效感染、转移的DNA片段大、目的基因表达时间长等优点，在基因过表达和沉默中获得了广泛应用，包括在体外细胞水平和体内感染等。

本发明将采用慢病毒技术表达特定的癌基因同时沉默抑癌基因，诱导树鼩胰腺癌模型。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的是针对现有胰腺癌模型的不足，提供一种以与人类亲缘关系更近的动物——树鼩，建立诱导周期短、诱发率高且稳定、操作简单方便的胰腺癌动物模型的方法。

本发明的建立胰腺癌模型的方法，根据TCGA数据库人类胰腺癌中变异率最高的癌基因和抑癌基因，构建过表达一个癌基因、同时敲降两个抑癌基因的慢病毒，在胰腺头部原位注射此慢病毒，以诱导胰腺癌的发生。

所述的同一个慢病毒载体中过表达人类胰腺癌中变异率最高的癌基因为Kras，同时敲降抑癌基因为TP53和CDKN2A。

所述的以与人类亲缘关系更近的树鼩为对象，将慢病毒原位注射到树鼩胰腺头部以诱导胰腺癌发生。

本发明的建立胰腺癌模型的方法，具体包括以下步骤：

(1)慢病毒载体的构建

根据TCGA数据库中人类胰腺癌变异率最高的癌基因Kras和抑癌基因TP53和CDKN2A，以pTomo空载体为出发质粒，通过一系列常规的酶切连接在CMV启动子后面引入Kras^G12D以过表达Kras^G12D，然后用自带H1启动子的shRNA敲降TP53和CDKN2A；

(2)病毒包装、滴度测定及体外验证