[发明专利]检测甲霜灵残留的酶联免疫试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测领域，具体涉及一种用于检测甲霜灵药物残留的酶联免疫试剂盒，其特别适用于烟草、茶叶、蔬菜样本中甲霜灵残留的检测。

背景技术

甲霜灵（Metalaxyl），D,L-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(2'-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯,是一种新型的具有保护和治疗作用的内吸性杀菌剂，可被植物的根、茎、叶吸收，并随植物体内水分运转而转移到植物的各器官，可以作茎叶处理、种子处理和土壤处理，对霜霉菌、疫霉菌、腐霉菌所引起的病害有效，在农业生产上常用来治疗葡萄霜霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜角斑病、辣椒疫病、烟草黑胫病、马铃薯晚疫病、番茄晚疫病、水稻立枯病、水稻青枯病、水稻恶苗病、玉米茎基腐病、玉米丝黑穗病、谷子白发病等病害，在农业生产和管理中，用途广泛。

甲霜灵属苯基酰胺类，高效、低毒、低残留农药，其内吸和渗透力很强，施药30分钟即可在植物体内上下传导，对病害植株有保护和治疗作用，且药效持续期长，故残效期长，从而造成其在农作物上的残留。我国针对不同作物，制定了甲霜灵最大残留限量标准，其中黄瓜、辣椒、番茄的最大残留限量为0.5mg/kg,糙米的最大残留限量为0.1mg/kg，其他谷物最大残留限量为0.05mg/kg。在实际生产中，以2mg/kg作为烟草最大残留量判定标准。

从现有技术和相关检测标准看，目前针对甲霜灵残留的检测方法主要是仪器方法，最常用的方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。

近年来药物残留免疫检测技术已经在食品质量安全快速检测中，得到了广泛的应用，且逐渐被人们所认可，酶联免疫检测技术具有样品前处理简单，检测快速、灵敏、特异性好、准确度高等特点，能够满足现场快速检测的要求，从而弥补仪器检测的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测甲霜灵残留的酶联免疫试剂盒，采用间接竞争ELISA方法，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法和试剂盒制备方法，该方法对烟草、茶叶和蔬菜的检测限为100μg/kg，灵敏度为1μg/kg。

本发明所述的试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、甲霜灵标准品溶液、高浓度标准品、酶标二抗、抗体浓缩液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为甲霜灵偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记抗抗体。

所述甲霜灵偶联抗原是由甲霜灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述甲霜灵半抗原是由水解反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述甲霜灵特异性抗体是以甲霜灵偶联抗原作为免疫原制备获得，所述甲霜灵特异性抗体可为甲霜灵单克隆抗体或甲霜灵多克隆抗体，其中优选甲霜灵单克隆抗体。

所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，其中优选羊抗鼠抗抗体。

所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括甲霜灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色液由底物显色液A液和底物显色液B液组成，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1-2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，所述显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1-2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.2-7.5，含有0.8%-1.0%吐温-20、0.03‰-0.05‰叠氮化钠防腐剂、0.1-0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。