[发明专利]用于检测水稻条纹病毒NS2基因的qPCR引物

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及用于检测水稻条纹病毒NS2基因表达量的qPCR引物。

背景技术

水稻在中国的分布十分辽阔，是我国重要的粮食作物，然而，水稻病毒病却严重影响着中国水稻的产量和质量。水稻条纹叶枯病(Ricestripevirusdisease)是水稻病毒病之一，该病害会造成水稻减产甚至颗粒无收，被称为水稻上的“癌症”。

水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)是水稻条纹叶枯病的病原物，它是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成员，由4条单链RNA组成，共编码7个蛋白，NS2是其中的一个蛋白，但目前对该蛋白的研究较少。2011年，NS2被本课题组鉴定为弱沉默抑制子，并与水稻编码的基因沉默抑制子3(supperssorofgenesilengcing3,SGS3)互作；2014年，本课题组又发现NS2能与水稻、烟草的纤维蛋白(Fibrillarin,Fib)互作，该互作关系影响了RSV的积累及运动。可见，NS2在RSV致病过程中起着重要的作用，对其进行深入研究，有利于完善对NS2基因功能及RSV致病机制的理解。

在研究基因功能时，往往涉及基因表达量的检测。半定量RT-PCR法是检测靶基因表达量的传统方法之一，但该法只是对基因的一个非常粗略的定量，误差较大；荧光实时定量PCR（qPCR）法是近几十年来新兴的检测靶基因表达量的方法，该法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，误差较小。在使用qPCR法时，设计合理的qPCR引物甚至、为关键，该发明所设计的引物尤为适合检测水稻条纹病毒NS2靶基因的表达量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测水稻条纹病毒NS2基因表达量的qPCR引物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于检测沉默植株中靶基因的表达量的qPCR引物，所述引物序列为NS2-qPCRF：ATCAACAGACGGAGCATC；NS2-qPCRR：CATTGGTTACAACTATGTGCTT。

所述qPCR反应体系20.0μL，包括上下游引物10μM各0.4μL，SYBRqPCRMix10μL，DEPCH₂O8.4μL，cDNA0.8μL；所述qPCR反应条件为：95℃，1min；95℃，15sec；60℃，45sec，共40个循环。

本发明的优点在于：

1.引物优点：GC含量为36%-50%，扩增片段大小为107bp，在优化的体系中，引物用量合理，上述优点保证了该引物扩增片段的特异性。

2.扩增产物的溶解曲线起峰单一，为单峰图，说明不含有非特异性扩增成分，说明产物为特异性产物，引物特异性好

3.琼脂糖电泳图表明扩增产物非常单一，无引物二聚体，说明引物特异性良好。

4.标准曲线显示相关系数R²为0.995,符合R²>0.98的要求；扩增效率为0.99，介于0.90~1.05之间，符合作为qPCR引物的要求。

上述表明该引物GC含量合理，特异性强，无引物二聚体，其对应的标准曲线符合qPCR引物要求，非常适合用于检测引物对应的靶基因表达量的检测。

附图说明

图1qPCR引物扩增的基因片段M:DNA标准分子量；1：水稻条纹病毒(RSV)；2：水稻草状矮缩病毒(RGSV)；3：水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)；4：阴性对照(灭菌水为模板)。

图2qPCR扩增产物溶解曲线，扩增产物为NS2。横坐标：相对荧光值；纵坐标：温度。

图3qPCR扩增曲线图(A:模板为RGSVcDNA；B：模板为RRSVcDNA)横坐标：循环数；纵坐标：荧光值。

图4感RSV水稻病株中NS2基因表达量纵坐标:相对表达量;横坐标:感染RSV水稻植株编号。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明

一、水稻病毒总RNA的提取及cDNA的转录

取感染水稻条纹病毒的水稻病叶0.1g，迅速放入液氮中，按北京全式金生物技术有限公司的RNA提取试剂盒(EasyPurePlantRNAKit)说明书提取RNA，具体操作如下：