[发明专利]一种定点突变改造的基因工程L-天冬酰胺酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(L-asparaginaseamidohydrolase，E.C.3.5.1.1)能够将L-天冬酰胺水解脱氨基形成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶具有抗肿瘤活性，目前已应用于治疗急性淋巴细胞白血病及霍金森病等，近年来研究发现L-天冬酰胺酶还可以减少油炸食品中丙烯酰胺的生成。L-天冬酰胺酶大小、结构及性质因来源不同而有所不同。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都发现含有L-天冬酰胺酶。

本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)的L-天冬酰胺酶分子结构、提高酶活。

异源表达L-天冬酰胺酶突出的问题是，蛋白表达量低、L-天冬酰胺酶酶活低。因此，定点突变改造L-天冬酰胺酶，提高胞外酶活，对于提高L-天冬酰胺酶工业化应用前景具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法。

本发明提供一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQIDN0.1所示的序列。

所述突变体的核苷酸序列是SEQIDN0.3所示的序列。

所述突变体是在如序列SEQIDN0.2所示的氨基酸的基础上，将166位氨基酸由丝氨酸突变成丙氨酸。

前期研究工作中，本研究团队已获得一种产L-天冬酰胺酶的枯草芽孢杆菌工程菌，该枯草芽孢杆菌表达核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的L-天冬酰胺酶。

所述编码SEQIDN0.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDN0.4所示的序列。

本发明还提供一种表达所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDN0.4所示序列的基础上，将第166位的丝氨酸突变成了丙氨酸，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

所述表达载体是pMA5。

所述的制备方法，具体是:

(1)以SEQIDN0.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQIDN0.5所示)，Rlprimer(序列如SEQIDN0.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDN0.3所示的重组基因S166A。

(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-S166A，重组质粒化转化B.subtilis168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为pMA5-S166A/B.subtilis168。

本发明在天然L-天冬酰胺酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L-天冬酰胺酶分子结构，得到一株酶活提高的L-天冬酰胺酶工程菌，比酶活较原始酶提高25％。突变体酶S166A_ansz的底物亲和力较原始酶降低20％，而催化效率提高8.4％。本发明表明166位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

具体实施方式

实施例1含L-天冬酰胺酶突变体的重组载体的构建

(1)S166A突变体的获得：以SEQIDN0.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQIDN0.5所示),Rprimer(序列如SEQIDN0.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDN0.3所示的重组基因。

(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-S166A。测序工作由上海生工完成。

实施例2产L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pMA5-S166A化学法转化入B.subtilis168感受态细胞，具体方法如下：

(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：