[发明专利]一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法

权利要求书

1.一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将裂殖壶菌ATCC20888菌种接种至装有种子培养基的摇瓶中，于25～35℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养20～35h；

所述的种子培养基的配方为：葡萄糖30.0g/L～50.0g/L、酵母抽提物5.0g/L～15.0g/L、Na₂SO₄ 12.0g/L～16.0g/L、MgSO₄ 1.8g/L～2.2g/L、K₂SO₄ 0.60g/L～0.70g/L、(NH₄)₂SO₄0.8g/L～1.2g/L、CaCl₂ 0.25g/L～0.26g/L、KH₂PO₄ 1.8g/L～2.2g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；

其中，微量元素溶液的配方为：FeSO₄·7H₂O 0.50g/L～0.55g/L、MnCl₂·4H₂O 0.82g/L～0.88g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.40g/L～1.45g/L、CoCl₂·6H₂O 0.005g/L～0.008g/L、NiSO₄·6H₂O 0.05g/L～0.07g/L、CuSO₄·5H₂O 0.5g/L～0.7g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.008g/L～0.012g/L；

(2)将步骤(1)得到的种子液转接到装有种子培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5～10％，于25～30℃、150～250rpm条件下进行恒温恒转速培养16～20h，测量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L，则直接进行步骤(4)；

(3)若步骤(2)得到的种子液中细胞干重没达到18～22g/L，则将其进一步转接到装有种子培养基的摇瓶中，按照步骤(2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L；

(4)将上述细胞干重达到18～22g/L的种子液以5～10％(V/V)的接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃、125～175rpm条件下进行发酵培养；

所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖100.0g/L～120.0g/L、酵母抽提物2.5g/L～3.5g/L、玉米浆干粉4.0g/L～5.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L～9.0g/L、Na₂SO₄ 12.0g/L～16.0g/L、MgSO₄ 1.8g/L～2.2g/L、K₂SO₄ 0.60g/L～0.70g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.8g/L～1.2g/L、CaCl₂0.25g/L～0.26g/L、KH₂PO₄ 1.8g/L～2.2g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；

(5)发酵培养30～40h后，待发酵液中葡萄糖含量降至30g/L以下开始分批流加葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖含量为30～50g/L，同时在发酵培养30～40h期间流加一次浓度为210.0～320.0g/L的混合氮源溶液，混合氮源的流加量为摇瓶装液量的1/5～1/4，该混合氮源含有酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠中的一种或多种；发酵培养至80～120h期间时，定期测定发酵过程葡萄糖消耗速率，待其降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，直至剩余葡萄糖耗尽后停止发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)～(3)中所述的摇瓶的体积为250mL，装液量为50mL。