[发明专利]一种基因工程菌及其在利用甘油生产2,3-丁二醇中的应用

说明书

技术领域

一种基因工程菌及其在利用甘油发酵生产2,3-丁二醇中的应用，属于生物工程中基因工程和发酵技术领域。

背景技术

随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越来越受到国内外的高度重视。生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源，以其具有环保和可再生性受到世界各国的关注，该产业在全球范围内迅速发展。但其经济性仍然不能与传统的化石能源相抗衡。其原因主要有两方面：一方面是原料油脂价格较高；另一方面就是副产物甘油没有得到很好的综合利用。在生物柴油的生产过程中可得到约10％的副产物甘油，在原料端成本无法有效控制的前提下，如何对副产物粗甘油进行深度开发，已成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障，同时也是无法回避的关键问题。如果能够利用生物柴油副产物甘油开发高附加值产品(如1,3-丙二醇、乙二醇、2,3-丁二醇等)，就能有效地降低生物柴油生产成本、提高资源利用率、延伸产业链，是建立高效、经济的生物质能源综合利用产业的重要措施，将大大提升生物柴油产业的整体技术水平和循环效益。

2,3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域。2,3-丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果；在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛的天然食用香料；脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1,3-丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2,3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值与甲醇(22.1kJ/g)、乙醇(29.0kJ/g)相当。另外，2,3-丁二醇及其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。

近年来用糖质原料发酵生产2,3-丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物法生产2,3-丁二醇尚未实现工业化。然而从2,3-丁二醇的应用前景、生产技术成熟度、知识产权状况及未来发展趋势看，开发以廉价的非粮糖质为原料(如生物柴油副产物粗甘油)发酵生产2,3-丁二醇具有很好的发展前景。目前报道的2,3-丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等，但这些菌大都是用糖质原料发酵生产2,3-丁二醇，而在国内利用粗甘油为原料生产2,3-丁二醇还未见报道；另外，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求。因此，使用安全菌种利用甘油发酵2,3-丁二醇具有良好的工业化前景。申请人前期公开了一种利用一株安全菌株BacillussubtilisCTCCM2009200发酵生物柴油副产物粗甘油生产2,3-丁二醇的方法(ZL201210360637.2)，为生物柴油副产物粗甘油进行工业化深度开发提供了基础。但是，该菌株发酵效率较低，不适合工业化生产要求，本发明基于此，对该菌株进行基因工程改造，提高其利用甘油合成2,3-丁二醇的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因工程改造BacillussubtilisCTCCM2009200的方法，提高其利用甘油发酵生产2,3-丁二醇的效率。

本发明所使用菌种为BacillussubtilisCTCCM2009200(已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CTCCM2009200，相关信息已在专利ZL201210360637.2中公开)。本发明首先从BacillussubtilisCTCCM2009200中克隆出参与2,3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因甘油脱氢酶(gdh)和乙偶姻还原酶(acr)以及调控2,3-丁二醇支路关键酶酶活的调控因子aslR，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gdh,acr和aslR基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，并转入BacillussubtilisCTCCM2009200中，获得加强gdh,acr和alsR基因表达的重组枯草芽孢杆菌(命名为GAR)。并对原始菌及重组菌GAR利用甘油合成2,3-丁二醇发酵性能检测，说明加强gdh,acr和alsR基因的表达能够提高2,3-丁二醇产量，降低副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累。