[发明专利]维生素D3的偶联物及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及脂溶性维生素的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及维生素D3的偶联物及其制备方法与应用。属于维生素免疫检测领域。

背景技术

本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：

BSA：牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin）,Sigma公司产品

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）(0.01M,pH=7.40)

cBSA:经乙二胺修饰的牛血清蛋白

透析膜：美国联合炭化（UnitedCarbide）公司产品

维生素D₃：中国标准品质检所

CDI：N,N'-羰基二咪唑,Sigma公司产品

DMAP:4-二甲氨基吡啶，Sigma公司产品

维生素D是一种脂溶性类固醇激素前体，主要由皮肤经光照后产生。维生素D本身无生物活性，必须在肝脏和肾脏相继接收2次羟基化才能生成具有生物活性的1,25-羟基维生素D。维生素D的两种重要形式包括维生素D₃（胆钙化醇）和维生素D₂（麦角钙化醇）。维生素D₃（胆钙化醇）主要是由人体自身合成的，人体的皮肤含有一种胆固醇，经阳光照射后，就变成了维生素D₃。所以，如果孩子能充分接受阳光直射皮肤4-6小时以上的话，自身合成的维生素D₃，就基本上能满足。但是紫外线照射带来的皮肤癌上升、空气的污染、各地天气变化等问题的影响下，各国人群接受日照的时间都在减少，并且很多国家明确规定要限制接受日照的时间，因此全世界范围内维生素D均呈现广泛缺乏的现象。

中国营养协会建议中国儿童和成人的可耐受最高摄入量为800IU/d。但从国际对D₃的应用看来，大部分国家在日照较少的季节，对婴幼儿的日摄入量已经提高到800-1000IU/d，而孕妇和普通成人如果检测为维生素D3缺乏，在开始1-2个月，日摄入量会要求提高到2000IU/d甚至更多。通过膳食来源的维生素D₃一般不会引起中毒，也就是说天然的维生素D₃，和食品级的天然维生素D₃补充剂一般不会引起中毒。而大剂量的化学维生素D₃和强化维生素D₃的奶制品有发生维生素D₃过量和中毒的可能。因此，检测营养强化食品中维生素D₃的含量非常有必要。

发明内容

在脂溶性维生素含量检测中，仪器法如液相色谱法和质谱等是应用最广泛的方法。虽然这些方法准确，稳定，可靠，但是由于仪器法价格昂贵，费事较长，且造成有机溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于应用于现场操作。酶联免疫检测法（ELISA）提供了一种极好的检测手段。该方法具有快速，准确，简易，不需要专人操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的检测手段。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。维生素D3是一种小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之半抗原。所以，必须把微生物D3转化为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原（又称之为完全抗原）。经检索，世界上尚未有关于维生素D3的免疫原合成及抗体制备过程的报道，而且维生素D3的ELISA试剂盒大都购于国外，保存期短，价格高，远不能满足检测需要，因此研究维生素D3的免疫原的合成及抗体制备显得格外重要。

具体实施方式

实施例1

（1）溶液A的制备：在50mL圆形反应瓶内，搅拌中（120转/分钟），加入维生素D₃19.20mg(0.050mmol)，N,N'-羰基二咪唑（CDI）16.2mg以及4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.6mg溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF）中，反应4小时生成维生素D₃与CDI的活性中间体。

（2）溶液B的制备：在25℃下，取cBSA171mg（0.0025mmol）溶于15mLPBS（pH=7.4,0.01M）中。在磁力搅拌下（120转/分钟）将A液逐滴加入B液中，反应6小时得溶液B。