[发明专利]16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒（HPV）属乳头瘤病毒家族，是一种小型无包膜的DNA病毒。病毒颗粒由单拷贝DNA和蛋白质组成，具有双链闭环DNA基因组，大小约8000bp，其基因组由三个基因区组成，包括含有8个早期开放阅读框的早期区（Early Region，E），有2个晚期开放阅读框的晚期区（Late Region，L）和非编码长控区（Long Control Region，LCR）。早期区编码与HPV复制、转录和细胞转化相关的蛋白；晚期区编码HPV的结构蛋白，如组成病毒衣壳的主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。HPV各型的本质区别在于L1区核苷酸序列的差异。

目前已知的HPV型别有100多种，其中约40种涉及生殖道感染，约20种与肿瘤相关。根据HPV感染与宫颈病损的关系，将其分为高危型（致癌型）、可能致癌型、低危型。高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68等，与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变(CIN）相关。低危型HPV包括HPV6、11、42、43和44等，常引起生殖道尖锐湿疣等良性病变。HPV感染的亚型分布具有一定的地域性差异，文献报道，中国妇女宫颈癌组织中HPV检出率较高的型别为16、18、58、31、33等亚型，第16型占51%，第18型次之，占16.2%。但在拉丁美洲33型最常见，其次是39和59型，在亚洲国家中，除了l6和18型之外，58和52型引起的宫颈癌所占比例较西方国家及非洲国家多。

人类乳头状瘤病毒感染率高低主要取决于人群的年龄和性行为习惯。许多研究发现性活跃的年轻妇女HPV感染率最高，高峰年龄在18~28岁，随着年龄的增长而明显下降。大多数HPV感染可在短期内消失，机体通过自身免疫系统使病毒逐渐清除，尤其是低危型别HPV更容易被机体清除，大约持续18个月左右。但对于高危型别HPV感染，许多研究报道其感染的高峰年龄是20~30岁，此阶段感染为暂时性，感染率较高，可达到25%~30%，此后，感染率逐渐下降。

高危型HPV的持续性感染与宫颈癌的发生有关。子宫颈HPV感染后可有三种临床过程。①隐匿感染：病毒基因组呈稳定状态，寄宿于宿主细胞但不整合入上皮，子宫颈鳞状上皮无临床和形态学的感染证据，但DNA技术可显示有HPV感染；②低危型HPV感染：HPV持续复制使鳞状上皮良性增生形成尖锐湿疣或引起低度鳞状上皮内病变（LSIL）；③高危型HPV感染：HPV-H基因整合入宿主基因组，干扰控制增生的癌基因和抑癌基因的表达，在临床上常表现为高度鳞状上皮内病变（HSIL），即发展至CINII以上病变。在妇女的一生当中可重复感染HPV，也可同时感染多种不同型别的HPV，从宫颈上皮内瘤变（CIN）到发展为宫颈癌，一般需要10~20年，而HPV多重感染可能使该病变时间缩短。据报道宫颈浸润癌的5年生存率是67%，宫颈早期癌是90%，而宫颈原位癌则几乎是100%。因此，早期筛查、早期诊断能有效降低宫颈癌的发病率和病死率。

随着人们对HPV和宫颈病变关系认识的逐渐加深以及医学实验技术发展，HPV感染的检查方法也由组织细胞水平发展到分子水平，主要包括细胞学检测方法、组织病理学检测方法、HPV DNA和RNA检测方法等几大型。其中细胞学技术是检测HPV感染的一种简便而经济的方法，常用于HPV的过筛检查。但实际工作中由于刮片、固定方法或阅片技术等多种因素的影响常造成较高的假阴性率。且细胞学技术不能直接检测到HPV本身，无法对HPV进行分型；阴道镜检可发现低度和高度异常，但无法发现微浸润疾病。另外，阴道镜检查的准确性通常受其自身及检查者的经验和技术水平影响，常造成假阴性，且其特异性较低，成本较高。

以基因扩增为基础的HPV DNA检测是目前最灵敏的检测方法，可以检测出低水平的病毒感染，并且能够比较准确地对HPV感染状态进行分类，也可检测潜在期感染。对于HPV DNA检测，有两种不同的PCR方法，即型特异或通用引物PCR。型特异PCR就是应用仅扩增某个HPV基因型的引物，因此为了检测一个临床样本是否存在HPV DNA，必须单独进行多个型特异的PCR反应。目前国内已经获得批准上市的HPV PCR检测试剂产品仅有深圳匹基一家公司，该公司此产品即是分别针对HPV6/11、16/18四个型别进行片段特异性扩增和分型检测。该法总的来讲，劳动强度大、一次可检测的标准数量较少，费用昂贵，而且无法检出新的HPV亚型。