[发明专利]一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性、高度接触传染性呼吸道传染病，本病呈世界性分布，是严重危害养禽业的最主要疫病之一。疫苗免疫是预防和控制鸡传染性支气管炎发生的最有效途径，而免疫后抗体水平的高低反映实际的疫苗免疫效果，直接关系到免疫鸡群对鸡传染性支气管炎病毒的抵抗力。鸡传染性支气管炎疫苗免疫鸡后血清中的病毒抗体可通过酶联免疫的方法检测，酶联免疫吸附试验系统经证实在IBV抗体水平的定量检测上是有效的，有利于检测大规模群体的免疫状况。血清中的IBV抗体(主要包括IgG)水平及整个鸡群的免疫状况可用ELISA方法进行检测。该方法是将抗原包被在微孔板上，加入稀释后的血清并孵育，血清中的抗IBV抗体将与包被在微孔板上的IBV结合，形成IBV抗原-抗体复合物，洗掉未结合的物质，加入过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记的抗鸡IgG的酶标结合物至微孔板中，酶标物将与IBV抗原-抗体复合物结合，孵育后洗掉未结合的酶标物，然后加入底物溶液，底物与碱性磷酸酶进一步发生反应并生成一种带有蓝色或黄色等颜色的产物，最后通过加入终止液终止酶活性反应，将颜色固定，颜色的深浅可用酶标仪(405-410nm或者630-650nm)测定，测定值的大小反应抗体水平的高低，还可通过一定的计算方法来界定血清中抗体的转化情况。可见，抗体间接ELISA检测方法是传染性支气管炎抗体水平定量检测的有效方法，具有重要的应用价值。

IBV的核蛋白作为一种主要结构蛋白,具有高度保守性,不同血清型间同源性高达94％～99％。并且有高度免疫原性，能诱导产生抗体。所以，核蛋白是IBV群特异性血清学检测诊断抗原的最佳选择。Ndifuna等人以及杜恩岐等人用大肠杆菌原核系统体外表达IBV的全长核蛋白，表明其具有免疫原性，郝春丽等应用原核系统体外表达IBV的全长核蛋白作为抗原建立了NP-ELISA抗体检测方法，可用于的诊断。然而，基于原核系统表达的IBV核蛋白N-末端部分抗原性更加特异，将该特异蛋白用于抗原开展抗体检测的研究和应用均未见报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于原核系统表达的鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种鸡传染性支气管炎间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒含有经过纯化的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白N-末端160个氨基酸的部分核蛋白的酶标板，其中鸡传染性支气管炎病毒核蛋白编码基因的GeneBank登录号为AY839143.1。

优选地，所述鸡传染性支气管炎病毒，为鸡传染性支气管炎病毒毒株ck/CH/LJL04I。

优选地，所述N-末端160个氨基酸的重组蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

优选地，所述N-末端160个氨基酸的重组蛋白的制备方法步骤如下：

1)通过RT-PCR从传染性支气管炎病毒ck/CH/LJL04I扩增获得核蛋白基因N-端编码160个氨基酸的N160基因；

2)将步骤1)所得基因整合到质粒载体中，获得重组质粒；

3)将步骤2)所构建的重组质粒转化到宿主菌中并诱导表达，获得菌液；

4)分离并利用亲和层析技术纯化步骤3)所得菌液，获得重组N160蛋白。

优选地，步骤1)所述扩增，所用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示。

优选地，步骤2)所述质粒载体，是质粒pGEX-6P-1。

优选地，所述酶标板的制备方法如下：

1)向酶标板的每孔中分别加入含量为5μg纯化的鸡传染性支气管炎病毒部分核蛋白N₁₆₀的抗原溶液，4℃包被过夜；

2)利用洗涤液洗涤3-5遍；

3)再用250μL1-5％牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。

优选地，所述试剂盒还包括：

(1)10×PBST浓缩洗涤液：pH7.4，体积200mL；

(2)10×血清稀释液：pH7.4，体积200mL；

(3)酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡或羊抗鸡抗体，25mL；

(4)底物显色液：60mL；

(5)终止液：60mL；