[发明专利]确定空气中微生物种类及致病微生物污染状况的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中确定空气中微生物种类及致病微生物污染状况的方法。

背景技术

空气中悬浮的颗粒物粒径范围通常在10nm至100μm之间。由于大气颗粒物的形状并不规则，因此按照空气动力学直径的大小，大气颗粒物通常被分为TSP(Totalsuspendedparticulate，空气动力学直径≤100μm)，PM10(粗颗粒物，空气动力学直径≤10μm)，PM2.5(细颗粒物，空气动力学直径≤2.5μm)以及PM0.1(超细颗粒物，空气动力学直径≤0.1μm)等。国际社会对PM10与PM2.5这两种粒径范围的颗粒物的广泛关注，主要源于两个方面的原因：一、从悬浮颗粒物的粒径分布范围的角度来看，10μm左右粒径范围的颗粒物处于粗颗粒物相对丰度分布的峰值，是粗颗粒物的重要组成；同时粒径2.5μm左右的颗粒物一般处于粗、细颗粒物两个模态之间的峰谷，是大气颗粒物中粒径较小的一部分，并且也是由人类活动排放的污染物主要存在的粒径区间。二、以健康效应作为考量因素，由于人体生理结构的原因，对PM10与PM2.5大小的颗粒物没有完全的过滤和阻拦能力：一般空气动力学直径小于10μm的颗粒物可进入人的上呼吸道，小于2.5μm的颗粒物可进入支气管或支气管末端，在1μm以下的颗粒物可以达到肺泡，而小于0.1μm的时候甚至可以穿透肺泡进入人体血液循环。因此PM10亦被称为“可吸入颗粒物”，PM2.5亦被称为“入肺颗粒物”。PM2.5由于其粒径小，更易进入人体，并且比表面积较大，易富集空气中各种有毒重金属、酸性化合物、有机污染物以及细菌和病毒等微生物，对人体产生的潜在健康危害更大，PM2.5对人体健康的影响主要包括：对呼吸系统的损害、对心血管系统的影响、对神经系统的影响、对免疫系统的影响，同时与癌症和出生缺陷也有一定的关系。

作为在大气颗粒物形成过程中起到重要作用，并在可吸入颗粒物中占比可达4％-80％的微生物成分，在以前的研究中鲜有涉及，这主要是源于生物组分的鉴定没有化学组分的分析快速或技术成熟，这直接导致人们对于可吸入颗粒物中微生物物种的认知非常有限。但显然的是，由于细菌的大小一般在0.2μm-10μm之间，理论上来说大多应聚集在可吸入颗粒物的粒径范围中，同时因为其具有生物活性并且部分具有潜在的传染致病性，了解它们的组成分布对理解可吸入颗粒物对人类健康的影响是非常必要的。在美国，每年的医院内感染有130万起，9.9万人会因此而丧命。而在我国，目前的几项大规模的研究报道指出，类似肿瘤医院院内感染约为2％-3％，而漏报约2％。除此之外，其他特定环境例如家居、医院、食品厂、药厂、大型公共生活、娱乐场也易发生感染。良好的环境空气微生物检测手段例如特定环境空气中的微生物种类、环境污染状况的检测至关重要，然而，现阶段此类研究仍有待加强。

目前的空气微生物物种鉴定方法主要包括培养与DNA序列比对。通过培养的方法鉴别颗粒物中的物种一般不受颗粒粒径的影响，但由于环境微生物大部分都不可在实验室条件下培养，因此可鉴定物种的数量非常有限(包括有限的细菌和真菌)；并且由培养出的单位菌落数推算空气中实际的微生物浓度并不准确。由DNA序列鉴定微生物种类的方法主要是通过扩增细菌的16SrRNA序列(或真菌的18SrRNA序列)，经微阵列芯片或测序获得碱基组成信息并与数据库中已知种类的序列进行比对。但因为可吸入颗粒物的粒径与TSP相比小了一个数量级，其中的生物组分或可提取的DNA量相对较少，所以目前绝大部分空气微生物的研究仍基于TSP进行。

但16SrRNA扩增技术使得细菌种类的鉴别只能局限在“属”或“属”以上水平，由于细菌的致病能力在“种”或“株”之间相差都很大，因此对致病菌的理解不够充分；并且指数扩增带来的误差使得菌群相对丰度的计算并不准确。同时，对样本的一次处理(比如只做16SrRNA扩增)只能获得细菌的序列信息，如需了解真菌的组成还需再次进行18SrRNA序列扩增，二次操作使得计算细菌和真菌的相对含量误差加大。另外，一般使用的扩增引物为16S通用引物，但实际上通用引物是基于有限数量的已知序列设计的，并不一定对所有的物种都“通用”，可能在某些物种序列的扩增上效率较低，同样带来扩增误差。考虑到空气传播的微生物对人的健康影响，病毒也是不可忽略的病原体，但也会被16SrRNA扩增检测所忽略。