[发明专利]一种中大型植物外植体的灭菌方法

说明书

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种中大型植物外植体的灭菌方法。所述灭菌方法包括：浸泡步骤：将外植体在乙醇溶液中进行浸泡处理，得到浸泡后的外植体；灼烧步骤：将所述浸泡后的外植体进行灼烧处理，得到灭菌后的外植体。本发明无需采用次氯酸钠溶液、升汞溶液等对外植体进行消毒，无需对大量蒸馏水进行高压灭菌，所以操作简单、节省试剂、成本低廉、对环境友好，使用范围广泛，应用价值高。

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种中大型植物外植体的灭菌方法。

背景技术

外植体的有效灭菌是所有植物组织培养的重要一步。植物组织培养是指从植物体上截取需要的细胞、组织或器官，通过无菌操作，在人为调控下进行培养，广泛应用于濒危、稀有植物的长期保存、经济植物的快速繁殖、远源杂交畸形胚或未成熟胚胎的挽救、培养，新型种质资源的创造(DH、基因工程、细胞融合)、脱毒复壮等领域。

与医疗器械、食品加工等行业的消毒不同，保持外植体在消毒后依然具有较高的生命力是植物组织培养必须要坚守的原则。物理消毒法，如辐射消毒、高温、高压、蒸汽灭菌等都会导致外植体死亡。因此组织培养领域对外植体的消毒方法均是采用化学法。从植物组织培养消毒技术诞生至今，相关的科研人员都在探索使用何种化学试剂才能到达有效灭菌的目的。

常用的化学试剂有乙醇、次氯酸钠、氯化汞(升汞)、过氧化氢、次氯酸钙和硝酸银。氯化汞较难在随后的洗涤过程中去除，且对外植体有毒副作用。过氧化氢是强氧化剂，滴落到皮肤后会有灼伤感。氯化汞和过氧化氢作用较强，如果浓度稍大或时间略长，外植体很容易死亡。次氯酸钙容易吸收空气中的水分，影响灭菌效果。硝酸银也是强氧化剂，但灭菌能力不如氯化汞和过氧化氢，价格又比乙醇和次氯酸钠贵，所以较少采用。综合灭菌效果、安全系数和价格因素，乙醇和次氯酸钠是目前最为广泛使用的化学试剂。

乙醇和次氯酸钠组合使用可以满足一般常见外植体的消毒要求。目前植物外植体的通用消毒方法是：体积百分比浓度为75％的乙醇表面处理20秒-90秒后，再用体积百分比浓度为2-15％次氯酸钠水溶液消毒8-20分钟，再用无菌蒸馏水漂洗2-4次，每次1-2分钟。采用该消毒方法，需要对大量蒸馏水进行高压灭菌以制备得到无菌蒸馏水。如果不能达到灭菌效果，再使用其它的化学试剂。

有些中大型外植体，如百合果实、茄果类幼果、葫芦科幼果、薯蓣科块茎等等体积较大，一般长度或者长径超过4cm，采用目前业界通用的消毒技术，有以下几个缺点：1、受灭菌器材的限制，每次只能对几个外植体进行消毒，灭菌效率低下；2、内部具较大空腔的外植体，如百合果实，内部空腔体积大，比重轻，密度小，在整个消毒过程中均漂浮在液体表面，容易导致表面消毒不完全，从而造成污染；3、薯蓣科块茎在土中生长，携带多种、大量菌类，不易彻底消毒，采用传统灭菌方法的灭菌效率低下。

因此，植物组织培养领域需要研发出一种针对于中大型植物外植体的、快速高效的、成本低廉的、操作简单的灭菌方法。

发明内容

本发明提供一种中大型植物外植体的灭菌方法，该方法将外植体先用乙醇溶液浸泡，再在火焰中灼烧并冷却。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种中大型植物外植体的灭菌方法，包括以下步骤：

浸泡步骤：将外植体在乙醇溶液中进行浸泡处理，得到浸泡后的外植体；

灼烧步骤：将所述浸泡后的外植体进行灼烧处理，得到灭菌后的外植体。

上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述外植体的长度或长径大于等于4cm，小于等于15cm。

上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述外植体为百合果实、番茄幼果、茄子幼果、西瓜幼果、薯蓣块茎。

上述灭菌方法的优选的实施方式中，所述浸泡步骤中，所述浸泡处理的时间为1-5秒，优选为1-3秒。