[发明专利]一种大肠杆菌DNA光修复酶及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种大肠杆菌光修复酶及其构建方法，特别属于大肠杆菌DNA光修复酶及其构建方法。

背景技术：

由于人类活动造成的污染与破坏，使得大气中的臭氧层愈发稀薄，阳光里的紫外光强度增加，对人类的伤害越来越大，特别是损伤细胞内部的DNA。紫外光破坏DNA的结构，会阻止DNA的正常复制和转录，会引起皮肤及组织细胞内的信号通路发生改变，造成免疫的抑制，皮肤的炎症，在细胞内积累大量的CPD甚至造成皮肤癌(李沛波，关永源，贺华，丘钦英et al.中波段紫外线对角质形成细胞凋亡的诱导和钙信号的影响[J].中国药理学通报，2004,20(4)：398-402.)。这主要是由于紫外光造成DNA同一条链上的相邻的胸腺嘧啶碱基产生环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimer，CPD)，该光化学产物使DNA结构异常。

大肠杆菌DNA光修复酶在可见光作用下，能够裂解还原环丁烷嘧啶二聚体，恢复DNA的正常结构。它是一种典型的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶，通过特异性地结合在DNA的嘧啶二聚体上，专一吸收波长300-500nm的近紫外可见光，从而产生活性，将环丁烷嘧啶二聚体还原为两个胸腺嘧啶，这是生物体利用光为驱动力来修复紫外线DNA损伤的重要途径。现有的DNA光修复酶主要用于动物模型和人体实验研究中，显示其在修复基因损伤及阻止基因损伤诱导的生物学效应中具有重要作用，但现有的DNA光修复酶的稳定性比较差，抗氧化能力比较低。

发明内容：

本发明所解决的技术问第1个技术问题是提供一种稳定性好的大肠杆菌DNA光修复酶。

本发明所要解决的第2个技术问题是上述光修复酶的构建方法。

本发明所要解决的第3个技术问题是提供上述变体基因编码的光修复酶或包含上述变体基因的表达单元、重组质粒、或宿主细胞。

定点突变(site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis)是指通过在目的DNA片段(质粒，基因组)中某些目标位点引入特定的变化(包括碱基的添加，删除，点突变等)。体外定点突变技术是研究蛋白功能与基因之间关系的主要手段，也是实验室里优化基因的常用手段，为改造及优化蛋白质提供了有力的条件。通过聚合酶链式反应(PCR)等方法将某个目的基因的特定碱基突变(碱基缺失或者插入等)，从而改变翻译出来的氨基酸序列，以及随之折叠成的蛋白质的空间结构和发挥的功能，有利于分析蛋白质结构和功能的关系。

本发明从现有的WT大肠杆菌(Escherichia coli)中获得DNA光修复酶基因(phr)，设计突变引物得到突变的基因片段，其编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，连接突变基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b-A377S；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于突变体酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-A377S；在18℃和1mM ITPG条件下获得了较好的表达。表达出的光修复酶活性更加稳定，而且酶的抗氧化效果显著提高。

附图说明:

图1为phr基因的PCR扩增图

M：DL2000；1：phr基因的PCR扩增产物

图2为A377S片段PCR扩增图

M：DL2000；2:A377S上游片段；3：A377S下游片段；

图3为A377S融合PCR扩增图

M：DL2000；4：A377S融合PCR产物。

图4为实施例1所制的光修复酶纯化的SDS-PAGE电泳图

S为破碎上清，P为菌体沉淀，E1-E6为纯化蛋白分管收集样品，LPM为低分子量标准蛋白。

图5为实施例1所制的光修复酶(A377S)及WT光修复酶的活性曲线

A377S：检测的是第1、2、4、7、9、13、44天的酶活性变化

WT：检测的是第1、3、5、6、11、41天的酶活性变化

图6为实施例1所制的光修复酶(A377S)及WT光修复酶的450nm吸收峰变化曲线。

A377S：检测的是第1、2、3、4、5、7、8、13、43天的450nm吸收峰的变化

WT：检测的是1、2、3、4、5、6、11、41天的450nm吸收峰的变化

图7为实施例1所制的光修复酶(A377S)及WT光修复酶的580nm吸收峰变化曲线