[发明专利]一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体及其构建方法。

背景技术

在基因工程中，要想得到大量纯化的目的蛋白质，需要构建一种能够高水平表达外源蛋白质的表达载体。而构建高效的表达载体选择要综合多方面的因素。启动子对外源基因的表达影响很大，是表达载体的一个重要元件。启动子严格调控着基因表达的时间和空间位置。启动子与受体细胞之间良好的兼容性对外源基因的表达有重要作用。同时，出于高水平表达的要求，这种启动子最好有较强的启动活性，并具有良好的调控系统。因此，构建包含合适启动子的载体，可以提高外源基因表达效率。随着基因治疗的发展，目的基因在病人体内的表达要求严格的时间和空间位置。组织器官特异性启动子的研究使得该方法有了很大进步，根据需要来构建合适的组织特异性启动子载体，不仅便于研究新基因的功能，还可阐明生物的生长、发育、分化及繁殖过程与机理，在特定的部位或发育阶段生产有用蛋白质或其它代谢产物，以实现对外源基因表达的定时、定点、定量二维精确调控。

利用肌肉特异性启动子，通过构建相应的表达载体，能够开启基因固定于肌肉中表达。通过外源基因的蛋白或RNAs在山羊的骨骼肌中的表达可很好的研究肌肉的分化或功能及改善肌肉的风味、质量。例如可利用肌肉特异性的启动子携带目的MieroRNA特异性的静默其靶基因在肌肉中的表达而不影响其他组织的此基因的正常表达，有效的获得目的基因对于肌肉组织的作用；同时可以利用肌肉组织特异性的启动子来研究那些通过QTL图谱定位及表达分析获得的可用于提高肌肉量的候选基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体构建方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种山羊骨骼肌特异性基因actin启动子驱动的Fat-1表达载体，该表达载体是首先将Fat-1基因克隆入pEGFP-N1载体，构建成pEGFPN1-Fat-1载体，然后将PCR扩增得到的CMV增强子插入无启动子和增强子的pEGFPN1-Fat-1载体，构建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体，最后将骨骼肌特异性基因α-actin启动子插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体中，构建成的α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表达载体。

该表达载体的具体构建过程为：

(1)利用平末端连接构建pEGFPN1-Fat-1载体：

将PCAGGS-Fat-1质粒经EcoRI酶切后回收Fat-1基因，将pEGFP-N1质粒经BamHI酶切后回收线性化的pEGFP-N1质粒载体，将回收后的Fat-1基因和线性化的pEGFP-N1质粒载体的cDNA末端补平，进行平末端连接构建成pEGFPN1-Fat-1载体；

(2)构建pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体：

根据PCAGGS载体的CMV-Enhancer序列，设计一对含有特异性酶切位点的引物，通过PCR方法扩增CMV-Enhancer基因，然后与19-TVector连接得到19-T-CMV-enhancer载体，利用SalI和AseI双酶切19-T-CMV-enhancer载体并回收酶切产物CMV-Enhancer基因片段，将酶切产物定向克隆到无启动子和增强子的pEGFPN1-Fat-1载体质粒中，构建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer载体；

所述的含有特异性酶切位点的引物为：

Enhancer-F：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC

Enhancer-R：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG

(3)构建α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表达载体：

采用分段PCR扩增的方法，分别从羊肌肉组织DNA中扩增1824bp和1347bp两片段Part1和Part2，同时首尾相连插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer质粒同一位置构建成α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表达载体；各片段引物为：

part1F:TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCCCTCACTATTCTTTT

part1R:CTGGGCAGCAGTTTTCCT