[发明专利]一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用

说明书

本发明提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用。所述方法包括：(1)将一基底浸泡在含0.4～3.2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，其中，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列；(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中进行钝化；之后再清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底。本发明提供的靶向引物的固定方法操作简单，对靶向引物的固定密度均匀，固定密度约为3000点/视野。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用。

背景技术

单分子测序技术被誉为第三代测序技术，其显著特征是可以高保真地对DNA片段直接进行识别，单分子测序技术由于能识别到单个核酸分子，其具有比第二代测序技术更高的检测灵敏度。DNA芯片的固定是单分子测序的第一步，DNA在芯片上的固定质量及密度决定着后续的单分子测序能否顺利进行。为此国内外研究人员致力于对芯片表面进行改性在表面引入各种官能团，如氨基、醛基、羧基、巯基等形成孔状的立体网架结构，使DNA与芯片表面的官能团共价结合进而稳定地固化于芯片的基底表面，提高DNA固定的密度。

世界上首个基于单分子测序技术(tSMS)的测序仪是由Helicos公司于2008年推向市场的。其原理是通过检测单个碱基荧光信号来实现边合成边测序。其中Helicos公司的单分子测序仪的固定技术中所用的引物为修饰有氨基的polyT序列或与待测DNA互补的DNA序列，然而，发明人通过实验表明，修饰有氨基的polyT的DNA很容易固定到表面修饰有环氧基团的基底表面，固定密度可以达到3000～5000/视野，但在同样的实验条件下，若将修饰有氨基的polyT引物更换为待测DNA互补的引物序列后，其固定密度只有100～200/视野。

为此，针对单分子靶向测序中与待测DNA序列互补的引物，需要进一步改进其固定技术，以推动单分子靶向测序技术(SMTS)的发展。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用。本发明提供的靶向引物的固定方法，通过在固定的靶向引物的5’端加了一定数目的PolyT，对靶向引物的固定密度均匀，固定密度可达2500～3200点/视野。

第一方面，本发明提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，包括以下步骤：

(1)将一基底浸泡在含0.4～3.2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，

其中，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列；

(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中进行钝化；之后再清洗基底，获得表面固定有靶向引物的基底。

如本发明所述的，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列。在该实施方式中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：polyT的5’端修饰的氨基与基底表面的环氧基连接。

优选地，所述靶向引物为5’端顺次连接有10～30bp的polyT以及烷基链的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

优选地，所述烷基链为-(CH₂)_n-的烷基链，其中，n为自然数。

更优选地，所述靶向引物为5’端顺次连接有10bp的polyT以及烷基链为-(CH₂)₆-的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

在该实施方式中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：-(CH₂)₆-通过氨基与基底表面的环氧基连接。