[发明专利]一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用

权利要求书

1.一种单分子靶向测序方法，其特征在于，包括：

(i)将靶向引物的5’端连接到基底表面；

(ii)将末端修饰有光学检测标记的模板核酸与所述步骤(i)中连接到基底表面上的靶向引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；

(iii)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；

(iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记的核苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链的3’端；获得延伸产物；

(v)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤(iii)中靶向引物/模板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸序列；

(vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：

(vii)重复步骤(iii)至(vi)一次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核苷酸。

2.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，靶向引物为5’端具有10-30bp的polyT的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

3.如权利要求1或2所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，靶向引物为通过5’端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基的基底。

4.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述模板核酸末端修饰的光学检测标记为荧光标记。

5.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述核苷酸的可断裂的基团为光可裂解的终止基团、化学断裂的终止基团或酶催化断裂的终止基团。

6.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像的步骤包括：

在每个延伸循环反应中，对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应后不同时间点进行成像。

7.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述步骤(iv)中，所述的对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像的步骤包括：在延伸反应后的同一时间点，对靶向引物/模板核酸复合物中的模板核酸、以及在该延伸反应中结合到靶向引物链3’端的带光学检测标记的核苷酸进行成像。

8.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法，其特征在于，所述步骤(iv)中，所述的进行图像比对和纠偏的步骤包括：

对同一位点的靶向引物/模板核酸复合物在延伸反应前后不同时间点的成像进行图像比对和纠偏；以及

对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。

9.一种单分子靶向测序装置，其特征在于，包括：

基底，用于固定一条或多条靶向引物；

流路系统，用于可控地操控各种试剂在基底所在的芯片腔室内的进出；

温度控制系统，用于调节和维持芯片腔室内的温度；

光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；

检测器组件，用于检测和记录荧光信号；

计算机，具有用于控制系统以及图像处理的各个模块，其中，所述图像处理模块用于对延伸反应前后靶向引物/模板核酸复合物的定位结果进行图像比对和纠偏，以及用于对该位点的模板核酸在该延伸反应后的成像与该延伸反应中结合到该位点的带光学检测标记核苷酸的成像进行图像比对和纠偏。

10.一种单分子靶向测序系统，其特征在于，包括如权利要求7所述的单分子靶向测序装置。

11.一种单分子靶向测序试剂盒，其特征在于，包括基底、如权利要求1所述的靶向引物、固定反应试剂、延伸反应试剂、成像试剂、切除光学检测标记分子的试剂。

12.如权利要求1所述的单分子靶向测序方法在在DNA或RNA测序中的应用。