[发明专利]一种克隆猪LYRM1基因CDS区序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，尤其是涉及猪的LYRM1基因CDS区序列克隆技术。

背景技术

LYRM1(LYR motif containing l)是应用抑制性消减杂交技术筛选肥胖者与健康人群腹膜脂肪组织的差异表达基因时所筛选出的一条新基因，该基因定位于人染色体16p11.2，有4个外显子和3个内含子，mRNA全长1589 bp，开放阅读框302-670 bp，编码122个氨基酸。前期研究发现该基因高表达于肥胖者脂肪组织，可促进前体脂肪细胞的增殖、抑制前体脂肪细胞的凋亡，过表达LYRM1基因可引起成熟脂肪细胞线粒体形态结构损伤和功能障碍，同时导致成熟脂肪细胞胰岛素刺激下葡萄糖摄取率的降低。朱冠忠等研究表明，LYRM1基因沉默能够引起成熟脂肪细胞Mfn2 mRNA表达水平升高，说明LYRM1基因沉默可部分影响成熟脂肪细胞线粒体形态相关基因。陈福坤等还发现LYRM1基因具有抑制P19细胞凋亡的作用，同时在人的心脏组织中高表达。邱洁等通过构建LYRM1绿色荧光蛋白融合载体，将LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中，构建了LYRM1原核表达载体及真核表达载体，并获取LYRM1重组蛋白，建立稳定过表达人LYRM1基因的3T3-L1前体脂肪细胞系。采用人工合成多肤作为半抗原成功制备了人类肥胖相关新基因LYRM1的多克隆抗体。吴丹等对北京油鸡不同日龄阶段体质量进行GWAS研究发现，在9个SNPs位点达5％全基因组显著水平位点基因包含LYRM1。梁慎等亦发现在西瓜枯萎病菌中LYRM1基因对调控生长发育及其致病性相关。

上述研究结果提示，猪LYRM1基因可能与其生产水平、肉质性状等有关联。国内未见关于猪LYRM1基因的相关研究报道，NCBI数据库中关于猪LYRM1基因的序列亦为预测序列，尚无准确的序列上传记录及相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种克隆猪LYRM1基因CDS区序列的方法，它准确性高，为构建猪LYRM1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。

本发明是这样实现的：克隆猪LYRM1基因CDS区序列的方法，对猪的组织提取总RNA，逆转录总RNA为cDNA后，设计特异性引物，上游引物：TGACATTCCTGAGACCAGAGT，下游引物：GGCCTACTTGACTCATCATTCT，扩增猪的LYRM1基因，扩增产物连接于pMD19-T Vector后，构建pMD19-T-LYRM1-CDS重组质粒，对重组质粒进行测序，克隆猪LYRM1基因为524bp，其中包含完整CDS区序列384bp，其余部分为UTR区序列。

本发明通过对猪的组织提取总RNA，逆转录为cDNA后，设计特异性引物扩增猪的LYRM1基因，PCR扩增的目的片段包含猪的LYRM1基因的完整CDS区序列及部分UTR区，最终构建pMD19-T-LYRM1-CDS重组质粒，并对其进行测序，测序结果与NCBI数据库中预测的LYRM1基因CDS区序列进行比对验证，为构建猪的LYRM1基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。

附图说明

图1为猪cDNA  LYRM1基因CDS区PCR产物电泳图；

图2为pMD19-T-LYRM1-CDS重组质粒PCR产物电泳图；

图3为pMD19-T-LYRM1-CDS重组质粒测序图谱。

具体实施方式

本发明的实施例：一种克隆猪LYRM1基因CDS区序列的方法，

1、猪总RNA的提取及cDNA合成

取白洗猪背最长肌组织进行总RNA提取，提取方法参照Invitrogen公司TRIZOL                                                Reagent试剂盒说明书进行，所得总RNA逆转录合成为cDNA，逆转录方法参照北京康为世纪生物科技有限公司HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。

2、猪LYRM1基因CDS区序列引物设计

参照NCBI数据库预测的猪LYRM1基因四个剪辑变异体序列（GenBank登陆号为：XM_005662093.1、XM_005662094.1、XM_005662095.1、XM_005662096.1）对猪LYRM1基因CDS区进行预测，针对预测序列进行引物设计，设计的引物序列如下：

上游引物序列：TGACATTCCTGAGACCAGAGT

下游引物序列：GGCCTACTTGACTCATCATTCT