[发明专利]一种ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用

权利要求书

1.一种ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体的筛选方法，由以下步骤制得：

1)第一链cDNA的合成：提取玉米种子总RNA和甘薯总RNA，以总RNA为模版，反转录合成玉米胚乳第一链cDNA和甘薯第一链cDNA；

2)PCR扩增：以步骤1)合成的第一链cDNA为模版，分别在扩增引物对的引导下，PCR扩增得到玉米的AGPase大亚基cDNA、甘薯的AGPase大亚基cDNA、玉米的AGPase小亚基cDNA和甘薯的AGPase小亚基cDNA；所述玉米的AGPase大亚基cDNA为玉米胚乳AGPase大亚基Shrunken-2cDNA；所述甘薯的AGPase大亚基cDNA为甘薯大亚基L1cDNA或甘薯大亚基L2cDNA或甘薯大亚基L3 cDNA或甘薯大亚基L4cDNA；所述玉米的AGPase小亚基cDNA为玉米胚乳AGPase小亚基Brittle-2cDNA，所述甘薯的AGPase小亚基cDNA为甘薯小亚基SIcDNA或甘薯小亚基SIIcDNA；

步骤2)中，

玉米胚乳AGPase大亚基Shrunken-2cDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.1Shrunken-2上游引物:

5'-CCCATATGCAGTTTGCACTTGCATTGGACACG-3'；

SEQIDNo.2Shrunken-2下游引物:

5'-GAGGTACCCTATATGACAGACCCATCGTTGATG-3'；

玉米胚乳AGPase小亚基Brittle-2cDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.3Brittle-2上游引物:

5'-CAAACCATGGACATGGCTTTGGCGTCTAAAGCC-3'；

SEQIDNo.4Brittle-2下游引物:

5'-GAGCTCTCATATAACTGTTCCACTAGGGAGTAAAGC-3'；

甘薯大亚基L1cDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.5iAGPL1上游引物：

5'-CATATGGTAGAAGCACCGATATTGG-3'；

SEQIDNo.6iAGPL1下游引物：

5'-GGTACCCTATATGACGGTTCCATCAC-3'；

甘薯大亚基L2cDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.7iAGPL2上游引物：

5'-CATATGGTAGAAGCTCCAAGACTG-3'；

SEQIDNo.8iAGPL2下游引物：

5'-GGTACCTTATATGACTGTTCCATCTTTG-3'；

甘薯大亚基L3cDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.9iAGPL3上游引物：

5'-CATATGGCTTTTGAGACACAGCAT-3'；

SEQIDNo.10iAGPL3下游引物：

5'-GGTACCTCATATGACTGTTCCATCTC-3'；

甘薯大亚基L4cDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.11iAGPL4上游引物：

5'-CATATGGCCAGGCCGAGGGTGAGC-3'；

SEQIDNo.12iAGPL4下游引物：

5'-GGTACCTTATATGACCAATCCATCAGG-3'；

甘薯小亚基iAGPSIcDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.13iAGPSI上游引物：

5'-CCATGGCAGCAGCGACGATCGGAGCACTGTCG-3'；

SEQIDNo.14iAGPSI下游引物:

5'-GAGCTCCTAGATGATGGTTCCACTGGG-3'；

甘薯小亚基SIIcDNA的扩增引物对为：

SEQIDNo.15iAGPSII上游引物:

5'-CCATGGCGGCAGCAATCGGAGCACCGAAG-3'；

SEQIDNo.16iAGPSII下游引物:

5'-GAGCTCTTATATTACAGTCCCGCTGGGG-3'；

3)构建AGPase大小亚基cDNA原核表达载体：

构建含有步骤2)得到的玉米的AGPase大亚基cDNA和甘薯的AGPase小亚基cDNA的AGPase大小亚基cDNA原核表达载体；或构建含有甘薯的AGPase大亚基cDNA和玉米的AGPase小亚基cDNA的AGPase大小亚基cDNA原核表达载体；

构建野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA的原核表达载体，作为对照品；

4)活性筛选：将步骤3)得到的AGPase大小亚基cDNA原核表达载体以及对照品分别转化大肠杆菌glgC突变菌株，筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养12-24小时，然后于Conberg加富培养基上进行划线，37℃培养12-24小时；用碘-碘化钾(I₂-KI)溶液进行染色菌落，筛选颜色较对照品更深的阳性菌落，得到高活性ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体；

所述Conberg加富固体培养基包括以下组分：磷酸二氢钾8-9g，磷酸氢二钾10-12g，酵母提取物5-7g，葡萄糖8-12g，琼脂15-25g，用水定容至1L，最终pH7.0；

碘-碘化钾溶液为含0.08-0.12mol/L碘和0.25-0.35mol/L碘化钾的水溶液。