[发明专利]包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺

说明书

本申请是申请日为2008年5月23日的中国专利申请200880016945.5“包含高浓度 的生物活性分子的组合物及其制备工艺”的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年5月23日提交的美国临时申请第60/939,792号的利益，其内 容在此通过引用并入。

技术领域

本发明涉及包含高浓度的诸如质粒的生物活性分子的大批组合物(bulk composition)以及制备这样的组合物的工艺。

背景技术

在细胞中产生并从细胞分离的生物活性分子存在许多用途。通过引用在此并入的 美国公布序列号20050014245公开了用于生物材料制备的设备和方法。生物活性分子包括 蛋白和核酸分子。在活细胞中制备这样的分子提供了相对可选择的制备方法的许多优势， 但当从细胞中提取生物活性分子时出现了分离和纯化问题。在细胞中存在多种组分，这阻 碍实现感兴趣的生物活性分子的高产率，也表示可能的不希望的污染物进入最终产品。

由于非病毒性基因疗法和DNA疫苗领域的出现，质粒制备是感兴趣的领域。质粒是 大的并且复杂的高分子，除非断裂，其保持超螺旋DNA结构。与其使用合成方法，在多种情况 下，在生物系统中制备它们并随后从那些系统中分离并纯化它们是更具有成本效益的。质 粒的生物制备通常采取使包含感兴趣的质粒的大肠杆菌(Escherichiacoli)(“E.coli”) 发酵的方式。

细胞溶胞和随后的用于制备用于纯化的工艺流的处理步骤是在任何质粒工艺中 最困难、复杂和重要的步骤。在该过程中，对于每次质粒制备的运行定义产率和质量。对最 佳方法的探求已经成为获得商业能力可接受的工艺的障碍，所述最佳方法是连续的、可缩 放的并且产生可以不管质粒尺寸以高浓度配制的高质量产品。

使用碱和洗涤剂溶解细菌以纯化质粒是常用的技术。令人遗憾地，该方法对于大 规模制备(或放大生产)呈现出显著的挑战。首先，含有溶胞溶液的悬浮细胞的完全混合在 小规模下通过简单地使包含该细胞的容器涡旋或颠倒而容易操控。然而，这在其中体积可 以在几十升或几百升范围内的大规模下是不现实的。用于混合大体积液体的常用技术，例 如叶轮混合，是有问题的，因为当某些细胞在最初的混合后开始溶解时，它们释放显著增加 溶液粘度的基因组DNA。这种粘度上的增加显著妨碍了进一步混合。另一挑战在于，在加入 碱性溶胞溶液后在高pH下过多的孵育可导致质粒的永久变性，使其不适于大部分随后的用 途，特别是用于治疗目的的用途。此外，众所周知，在该步骤的混合应当是完全的但足够温 和的(即，低剪切)以防止大量来自絮状沉淀的物质进入含质粒的溶液。大量的宿主基因组 DNA和内毒素存在于絮状沉淀中并且如果它们与质粒混合，它们在随后的纯化期间可能难 以从质粒中分离。因此，质粒的大规模制备以某种方式使大量细胞暴露于溶胞溶液、使其混 合并中和溶胞产物以最优化质粒产率、最小化质粒降解和最大化除去其他细胞成分以便该 物质可被进一步纯化而以相对大的体积制备高浓度、高质量、高纯度的最终产品。

存在多种纯化质粒的现有方法；然而，这些方法不适于大规模制备。实验室规模的 纯化技术不能简单地放大用于涉及大规模质粒制备的体积。大规模制备需要产率和分子完 整性的最优化而同时使污染物的去除和质粒浓度最大化。在制备大量高浓度的质粒DNA中， 存在将质粒维持为超螺旋形式和开环松弛形式的问题。储存条件通常需要高盐，并且即使 在盐存在下，随时间的分子降解仍然是个问题。许多现有的纯化方法依赖于使用潜在地危 险的、毒性的、诱变的或污染的物质和/或昂贵的物质或设备，这又是对于大规模制备所不 期望的。某些现有的纯化方法利用酶的使用以消化蛋白用于最终的消除，而这样的酶对于 大规模生产是昂贵的并且可造成生物污染的危险。

存在对诸如质粒的感兴趣的生物活性分子的大规模制备方法的需求，其中最终产 品可以具有成本效益的方式制备，所述具有成本效益的方式例如最少的设备和/或最少的 工艺步骤、高产率、高浓度和最少降解并且不存在杂质、污染物和不希望的物质。存在对具 有高浓度和最少降解及存在最少杂质、污染物和不希望的物质的大量质粒溶液的需求以及 对这样的溶液的制备方法的需求。对大量质粒的需求大于对是低拷贝数质粒的那些质粒的 需求，所述低拷贝数质粒需要非常大量的细胞以得到毫克(“mg”)范围和以上的质粒量。

发明内容