[发明专利]牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

权利要求书

1.用于检测牛HIF-1A基因转录水平的引物对，其特征在于，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。

2.用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，包括有以下试剂：2×SYBRGREEN MIX、标准HIF-1A基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水。

3.根据权利要求2所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，2×SYBR GREEN MIX、标准HIF-1A基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水的配比为5mL：500μL：500μL：5mL。

4.根据权利要求3所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述2×SYBR GREEN MIX由以下试剂组成：Taq DNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4 mmol/L、Mg²⁺5.0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、Tris.HCl 20 mmol/L、明胶0.02%、SYBR Green染料。

5.根据权利要求4所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述标准HIF-1A基因模板如序列表中序列3所示，标准HIF-1A基因模板的浓度为0.8μmol/L。

6.根据权利要求5所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，权利要求1所述的引物对组成的引物混合液中，引物一的浓度为8μmol/L，引物二的浓度为8μmol/L。

7.根据权利要求6所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述超纯水的纯度大于18.25 MΩ.cm。

8.用于检测牛HIF-1A基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）配制荧光定量PCR反应预混液：取2×SYBR GREEN MIX 1000μL、权利要求1-7任一所述的引物对组成的引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制得到1900μL的荧光定量PCR反应预混液；

2）将步骤1）得到的荧光定量PCR反应预混液按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或反应板中；

3）配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准HIF-1A基因模板，以及未稀释的标准HIF-1A基因模板，共6种，每种10μL，用于检测基因的扩增效率；

4）荧光定量PCR反应扩增：每个装有19μL 荧光定量PCR反应预混液的反应管或反应板中分别加入1μL待测cDNA、作为阴性对照的超纯水或作为阳性对照和计算扩增效率标准的HIF-1A基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪中，95 ℃下变性30秒，然后按95 ℃ 5秒，55.2 ℃ 20 秒热循环40次，并在55.2 ℃时检测记录荧光信号；

5）PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。

9.根据权利要求8所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤4）中，装有19μL 荧光定量PCR反应预混液的100个小管中，其中1管加入作为阴性对照的超纯水、6管加入作为阳性对照和计算扩增效率标准的HIF-1A基因模板，其余小管加入待测cDNA。