[发明专利]牛PPARG基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及牛PPARG基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2ⁿ倍扩增（其中n为热循环次数）。

荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术所发展起来的基因定量方法。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的量变情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数）；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

SYBRGreen是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这种性质使其应用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

Northernblot技术可检测基因的转录水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northernblot实验中一个主要的问题是RNA容易降解，所以NorthernBlot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等，这使实验过程变得比较繁琐。另外，NorthernBlot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。

基因芯片技术实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。

SYBRGreen在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYBGreen的灵敏度很高。但是，由于SYRBGreen与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光值的变化可以帮助降低非特异产物对定量结果的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到的定量结果。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorGamma，PPARG）又称格列酮受体，存在于动物的巨噬细胞、结肠和脂肪组织中，主要功能为调节脂肪酸存储和葡萄糖代谢，参与动物的脂肪细胞分化、脂质代谢、糖代谢和炎症反应。PPARG通过调控相关基因刺激脂肪细胞的脂质摄取和脂肪形成。因此，对动物PPARG基因的转录水平检测有助于监测动物的糖类和脂类的代谢水平，进一步对动物的生长发育状态有所了解。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简便、快速，且能够定量检测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorGamma，PPARG）基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于检测牛PPARG基因转录水平的引物对，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。

本发明的第二个目的是提供用于检测牛PPARG基因转录水平的试剂盒，包括有以下试剂：2×SYBRGREENMIX、标准PPARG基因模板、上述的引物对和超纯水。

进一步的，上述的用于检测牛PPARG基因转录水平的试剂盒，所述试剂盒中，2×SYBRGREENMIX、标准PPARG基因模板、上述的引物对和超纯水的配比为5mL：500μL：500μL：5mL。