[发明专利]大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用

权利要求书

1.大黄鱼C凝集素Nattectin, 氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.大黄鱼C凝集素Nattectin基因, 核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建pET-32a-Nattectin重组表达载体，具体方法如下：

(a)Nattectin基因的PCR扩增：

提取大黄鱼脾脏总RNA，以OligdT为引物扩增获得脾脏的cDNA,根据大黄鱼转录组数据设计引物如下：

PF:CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA，划线部分为BamH Ⅰ酶切位点；

PR:CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC，划线部分为EcoR I酶切位点；

以大黄鱼脾脏cDNA为模版，引物PF/R扩增获得约477bp的Nattectin基因；

(b)将PCR产物与pET-32a同时进行BamH Ⅰ和EcoR I双酶切并回收，然后16℃过夜连接；

(c)连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，获得转化菌，提取质粒并经双酶切鉴定，pET-32a基因正确插入到pET-32a相应酶切位点中，表明构建载体正确；

(2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21；

(3)转化子的发酵培养与诱导表达；

(4)重组蛋白Nattectin的纯化和复性。

4.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，所述构建pET-32a-Nattectin重组表达载体的具体方法如下：

用2条特异性引物扩增Nattectin基因开放阅读框，并将其插入表达载体的pET-32aBamH I和EcoR I多克隆位点间，经酶切鉴定和测序证明构建表达载体成功；

所述2条特异性引物为：

正向引物PF:CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA；

反向引物PR:CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC；

划线部分为BamH I和EcoR I内切酶位点。

5.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(2)中，所述获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21的具体方法为：

经热转化，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆菌株pET-32a-Nattectin-BL21。

6.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(3)中，所述诱导表达的条件为：菌液OD600值0.6～0.8，0.1mM的IPTG，18℃，90rpm过夜诱导12h。

7.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(4)中，所述重组蛋白Nattectin的纯化和复性的具体方法如下：

用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白，再复性得到可溶性蛋白。

8.如权利要求7所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于所述用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白的洗脱液配方为：160mM imidazole，8M Urea，100mMNaH2PO4，10mM Trisbase，pH 8.0。

9.如权利要求7所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于所述复性采用一步脱盐法复性，即脱盐柱直接对纯化的包涵体脱盐，同时达到复性和脱盐的目的，最终得到溶于PBS的重组蛋白。