[发明专利]一种血浆中游离的目标DNA低频突变富集测序方法

说明书

技术领域

本发明属于生物信息学高通量测序技术领域，具体涉及一种血浆中游离的目标DNA低频突变富集测序方法。

背景技术

近年来肿瘤患者血液中游离ctDNA(Cell-free Circulating Tumor DNA)的基因检测诊断已成为研究热点，研究显示血液中循环肿瘤DNA有可能成为一种新的肿瘤早期诊断，预后判断以及精确医疗的标志物。检测血液中循环游离DNA中的肿瘤标志物具有区别于传统组织肿瘤标志物的检测方式，具有无创、随时监控和早期筛查等优势，并且对循环游离DNA的取样检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难，是一种很有潜力的肿瘤标志物。然而在循环血中除了肿瘤游离DNA，也存在正常组织游离DNA，且因个体差异，肿瘤发生发展时期，治疗时期等原因，循环DNA的总量不定，且往往较癌组织相应频率低得多，尤其早期阶段的癌症血浆ctDNA的丰度甚至在0.01％水平，因此在血浆ctDNA的临床应用中，低频突变的精确检测是目前亟待解决的问题。

为高效实现对血浆ctDNA低频突变的精确检测以及应用潜能的充分发掘，富集扩增技术与高灵敏的检测技术的有力结合是必须的，然而目前相关技术如preMiDTM,CAPP-Seq，Duplex Sequencing等只能一定程度实现低频变异的检出，其相关实际应用或多或少仍存在一定局限性。preMiDTM融合突变偏向性扩增ARMS、荧光定量PCR和高分辨熔解曲线分析HRM 3种技术于一体，实现对非细胞体系的血浆微量突变检测，但是其检测灵敏度只能达到1％左右，而且只针对一些热点变异进行基因分析；CAPP-Seq的技术原理是将高通量测序技术与目标区域捕获技术结合起来应用于血浆ctDNA，对样本进行靶向捕获后再进行深度测序，基于相关数据过滤处理，不仅可以获得更多基因变异信息，而且可以得到0.2％以上，98％的高特异低频变异结果,但其距离基于血浆ctDNA的早期筛查，仍具有不小的差距。Duplex Sequencing基于UID(unique identifier)标签进行正反双链纠错，几乎可以矫正所有类型的测序错误，其检测到的突变频率可以达到10^-7，但是该技术存在一个巨大的限制性，其需要相对常规测序更高的测序通量，而且针对血浆ctDNA的高通量测序以解决0.01％左右的稀有突变检测，巨大的样品需求也是一个挑战。

发明内容

本发明提供一种血浆中游离的目标DNA低频突变富集测序方法以克服现有技术的不足。

本发明提供的一种血浆中游离的目标DNA低频突变富集测序方法，包括以下步骤：

(1)血浆目标DNA的提取与文库构建；

(2)通用文库TT-COLD PCR扩增富集；

(3)探针富集捕获、杂交捕获产物的扩增与上机测序；

(4)正反双链纠错低频信息分析。

本发明方法的流程图见图1。

其中，步骤(1)所述的血浆来自人类外周血，文库构建方法按照3步酶促反应，即末端修复，加“A”和文库接头连接。

文库接头使用的引物为：

接头第一链：TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

接头第二链：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。

本发明方法中，步骤(2)通用文库TT-COLD PCR扩增富集包括以下步骤：1)确定文库的Tm值；

2)绕过每个插入片段存在的特异Tc值，基于1对通用引物，在1个系列的循环条件下，对文库中所有片段上的各种突变类型进行富集；设定Tc min≈TM-2.5，之后Tc以0.5℃逐步递增，在每个Tc条件下分别进行FULL COLD PCR。

进一步地，文库Tm值通过以下方法来确定，对血浆目标DNA的文库采用一对引物使用荧光定量PCR，根据溶解曲线分析获得文库Tm值；所述引物的序列为：

上游引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

下游引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中xxxxxxxx为index标签。

上述步骤2)中，所述1对通用引物为通用文库TT-COLD PCR引物，其核苷酸序列为：