[发明专利]一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物微阵列芯片领域，涉及一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法。

背景技术

药物靶标是指体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子，绝大多数为蛋白。包括多种受体，酶等。所谓靶标垂钓是指，通过对多种蛋白混合物进行一次性筛选，从而来寻找和确认可能与“孤儿”药物小分子能够发生特异性相互作用的靶标蛋白。靶标垂钓一般是先将药物小分子固定在生物芯片表面，然后在芯片上流通多种蛋白混合物进行筛选，从而来确认能够与药物小分子相互作用的靶标蛋白。靶标垂钓的意义在于，第一，通过这项技术，可以针对旧的药物小分子发现新的靶标蛋白，从而实现老药新用；第二，通过研究药物小分子与靶标蛋白质之间的相互作用，可以探究药物小分子在治疗疾病过程中的机理。

然而，目前的靶标垂钓技术存在着两个比较严重的不足。首先，传统靶标垂钓技术的实现模式主要是一对多。即一种药物小分子针对多种混合蛋白进行检测，进而筛选出一种药物小分子与一种靶标蛋白的特异性结合。这种模式存在着极大的低通量弊端：即，一次通入多种蛋白混合液，只能筛选出一对相互作用。造成这种问题的主要原因在于，不同药物小分子之间结构上的特异性，使得现实中很难采取一种普适性的方法，将不同的药物小分子同时共价固定在生物芯片上，进行多靶标垂钓。其次，传统靶标垂钓技术的检测模式信息量不够丰富。传统靶标垂钓技术利用质谱作为检测手段，可以定量地表征筛选出来的靶标蛋白的分子量，从而将其与混合溶液中的其他蛋白区分开来。但是，为了探究药物小分子与靶标蛋白的相互作用，两者之间的动力学常数以及亲和力常数是非常重要的参数，因为它们分别反映了药物小分子与靶标蛋白的结合速率以及结合能力，这对于研发新药或者探究机理起到了决定性的指导作用。

因此，针对第一点不足，如何采用一种普适性的方法，在保证药物小分子与蛋白质发生相互作用的功能域不被破坏的情况下，将不同结构的药物小分子固定在同一张生物芯片上，从而实现高通量靶标垂钓，是该领域内人们普遍关注的问题。而最新发展起来的非选择性小分子微阵列技术为上述问题提供了解决思路。

小分子微阵列(SmallMoleculeMicroarray，SMM)是近十年来迅速发展的另一种高通量技术。SMM是指在固态表面上通过点样(或打印)然后固定各类有机小分子所形成的高密度微阵列——类似于广泛流行的DNA微阵列，一张玻璃(或塑料)衬底上可以打印上万个不同化合物的微阵列，得益于分析仪器的微型化，能够一次性、一步式地同时分析成千上万个生物化学相互作用。1999年，Schreiber等首次报道了小分子阵列，该阵列被作为探针，成功应用于FKBP12及其配基的检测。Schreiber在成功构建小分子阵列后，又成功实现了Hap3p功能抑制因子的识别；Tully等利用小分子微阵列成功发现了硫酸软骨素E和在治疗上非常重要的细胞因子TNF-α之间的相互作用。

由于小分子微阵列需要将大量的、不同化学结构或生化结构的小分子固定在载体表面，如何高效率地固定小分子，并且不影响小分子与蛋白靶标结合生化活性，一直是SMM技术最具有挑战性的难题。在众多的研究进展中，尤其以三氟甲基苯基偶氮丙因(Trifluoromethylaryldiazirine，TFMAD)功能团为基础的光交联表面化学最受瞩目。与其它偶氮卡宾光交联化学相比，TFMAD功能团具有较高的化学稳定性，所产生的卡宾中间体有高反应活性，重排几率低，碳插入反应产率高等优点。更为重要的是，仅需要相对低能量的365nm紫外光就可以激发卡宾的产生，从而降低了小分子探针被紫外光降解的几率。TFMAD光化学固定条件温和、可控性强，可通过掩膜在指定区域内进行修饰，可广泛用于各类生物分子的固定。此外，在固相条件下进行光交联可以避免可能由溶剂引起分子特定取向与功能团选择，分子与偶氮的随机性接触得到保证。然而，高通量小分子发展迅速，却从没有人将其应用于靶标垂钓领域，主要是缺乏一种既能实现靶标垂钓，又能满足高通量要求的检测手段。

针对传统靶标垂钓领域的第二点不足，选用一种既能表征药物小分子与靶标蛋白结合的动力学信息又能表征靶标蛋白分子量的检测手段将会极大促进靶标垂钓领域的发展。