[发明专利]一种与草甘膦特异结合的核酸适配体及应用

说明书

本发明公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合草甘膦的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，存在G‑四链体结构，吉布斯自由能DG=‑16.78；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到草甘膦。

技术领域

本发明涉及一种与草甘膦特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

草甘膦属低毒除草剂，主要抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干扰，导致植物死亡。而在果蔬、转基因大豆等制品中会有残留的草甘膦，人误食后15分钟内便产生呕吐及喉部疼痛现象，接着还会产生腹痛及腹泻症状，另外，草甘膦还与先天性心脏病以及其他先天畸形有关。因此，如何快速、准确、灵敏地检测出草甘膦防患于未然已成为亟待解决的问题。

核酸适配体是通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到的，能与靶分子特异性、高亲和力地结合的一类寡核苷酸分子（DNA或RNA）。由于其具有靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和疾病治疗领域中显示出了重要的应用价值。

发明人将本发明的草甘膦特异性核酸适配体的核苷酸序列和基因数据库进行了比对搜索，未发现有任何相同序列信息。

发明内容

本发明的目的是提供一种与草甘膦特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状；预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-16.78。

本发明另一目的是将与草甘膦特异性结合的核酸适配体应用在识别草甘膦或在制备检测草甘膦的试剂盒中。

本发明的技术方案如下：

1、草甘膦特异性核酸适配体（A08）的筛选、克隆、分离和测序

采用SELEX技术筛选出能够与草甘膦特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA）进行验证，得到适配体A08，它能够高亲和力高特异性的结合草甘膦。配体接头引物序列为：Aptamer Fw:GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；Aptamer Rv:GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定，测序结果表明与草甘膦特异性结合的核酸适配体(A08)由84个核苷酸组成，其序列（5’端至3’端）为：

tgctagacga tattcgtcca tccgagcccg tggcgggctt taggactctg cgggcttcgcggcgctgtca gactgaatat gtca；

2、核酸适配体（A08）单链DNA二级结构表征

使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form）对与草甘膦特异性结合的核酸适配体A08单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-16.78，显示该结构具有较高的稳定性；其二级结构如下：

3、核酸适配体（A08）的特异性和对草甘膦的敏感性

根据核酸适配体A08的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对A08的特异性和其对草甘膦的敏感性进行检测；结果显示，A08具有很高的特异性，其能检测到草甘膦的最低浓度为4 ng/μL。