[发明专利]氨糖类产品中甲壳源致敏性物质的PCR检测技术

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过PCR技术检测氨糖类产品中是否含有甲壳源致敏物质的方法。

背景技术

氨基葡萄糖指的是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物。分子式C₆H₁₃O₅N，俗称氨基糖，简称氨糖，又名葡萄糖胺，广泛存在于自然界，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通常以N-乙酰基衍生物（如甲壳素）或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚（胞壁酸）形式存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中。因此可以从微生物（以丝状真菌、高等真菌为主）或甲壳类动物（虾蟹）壳中提取氨糖。

氨基葡萄糖是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。随着年龄的增长，人体内的氨基葡萄糖的缺乏越来越严重，关节软骨不断退化和磨损。美国、欧洲和日本的大量医学研究表明：氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长。

氨糖能舒缓因关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀：骨质疏松症使软骨耗损，最终导致碎裂剥落，关节少了软骨的缓冲，易产生痛苦的僵硬和发炎，而氨糖有助于修复受损软骨，刺激新软骨的生成，改善发炎症状，舒缓关节疼痛、僵硬及肿胀；能强化软骨结构，预防关节功能失效：随着身体老化，关节组织会严重磨损，氨糖可以保护并强化软骨结构，预防因关节老化而产生的关节功能失效；能润滑关节及维持关节功能：氨糖可制造蛋白多糖润滑关节，防止骨关节摩擦疼痛，使关节活动自如。氨糖在美国食品药品监督管理局作为膳食添加剂进行管理，在欧洲，氨基葡萄糖被批准为药物，以硫酸盐的形式销售。

然而在联合国粮农组织提出的8大类引起过敏的食物中，虾、蟹等甲壳类动物及其制品是重要的一类致敏原。因此，源自甲壳类的氨糖有可能因为虾、蟹肉（蛋白）的清除不彻底，导致易过敏人群服用后发生过敏。所以对氨糖进行甲壳源致敏性物质的检测可以预防相应人群的发生误服过敏，并为氨糖的原料来源鉴定提供技术基础，为产品标志提供依据。

发明内容

本发明提供了一种利用PCR技术对氨糖产品进行检测的方法，能够快速、方便、准确的获知氨糖及其产品中是否含有甲壳类致敏原物质。具体方法如下：

（1）扩增引物序列：

crustacean1 F5’-TCTAAGCTGCGTACATATCG-3’

crustacean1 R5’-ATTATCACACTATTTCCTAC -3’

扩增片段长度为140bp；

crustacean2 F5’-CGCTAATCCAACAAGACAT -3’

crustacean2 R5’-CCATTCTGAACAGACATCA -3’

扩增片段长度为150bp。

（2）待测样品的DNA提取

处理方法按照Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver.3.0，抽提样品DNA。

（3）PCR扩增

PCR反应采用25μL体系，按以下组分配制PCR反应液：10×PCR缓冲液2μL，10μmol/L的正向和反向引物各1μL，dNTP（10mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA（含50±10ngDNA）1μL，加dH₂O补足25μL。PCR反应条件如下：94℃3min，94℃1min，66℃1min，72℃1min，35个循环；72℃7min结束反应。4℃保存反应产物，产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行观察。

本发明的优点：首次提出使用PCR方法检测氨糖中可能存在的甲壳源致敏物质，为提供高质量的氨糖提供了快速、方便的方法。

具体实施方式

实施例1 采用虾、蟹壳制备的氨基葡萄糖样品检测

将虾、蟹壳通过水解、脱色、浓缩、结晶、烘干的方法制备氨基葡萄糖（参考中国专利公开号CN104327129A），采用试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver.3.0提取其中的DNA，然后进行PCR。PCR条件见下：