[发明专利]一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列及其应用

说明书

本发明涉及针对鸡细胞周期蛋白F基因，构建抑制该基因表达效率最佳的shRNA慢病毒干扰载体。针对鸡细胞周期蛋白F基因设计的4个shRNA寡核苷酸序列，克隆到慢病毒干扰载体lentiviral vector中，构建出四个干扰载体，与包装质粒共转染293T细胞，上清培养液过滤后到病毒悬液，测定病毒滴度后以一定MOI病毒量感染鸡胚成纤维细胞系和鸡胚睾丸支持细胞，筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体。在分子生物学上通过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了鸡细胞周期蛋白F基因的表达。

技术领域

本发明涉及一种基因技术领域的RNA干扰序列，具体涉及一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列。

背景技术

细胞周期通常可以分为四个阶段：G1、S、G2及M，其中G1和G2期是细胞生长期，S期是细胞将细胞核内的染色体复制的时期；M期是细胞进行有丝分裂或者减数分裂的时期。细胞周期蛋白，又名细胞周期素(Cyclin)，是一类与细胞周期功能状态密切相关的蛋白质家族，已知的细胞周期蛋白有十余种，目前功能研究较为透彻的主要有Cyclin A,Cyclin B,Cyclin C,Cyclin D及Cyclin E，他们在细胞周期的不同阶段通过cyclin box激活周期素依赖性蛋白激酶(CDK)分别发挥作用。1994年Elledge实验室发现一种新的人类细胞周期蛋白，并将其命名为细胞周期蛋白F(Cyclin F，CCNF)。CCNF是细胞周期蛋白中分子量最大的一个，在已检测的所有细胞中均有表达。与其他周期蛋白不同，CCNF拥有cyclin box，但没有可激活的CDK，因此其功能可能区别于其他细胞周期蛋白。近年来，随着CCNF在不同的物种中被相继报道，功能研究也逐渐开展。鸡的CCNF基因位于14号染色体，全长由12568个碱基编码。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是发生在真核生物细胞内，基因转录后的表达被特异性抑制的现象。其作用机制是，细胞内的长双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)与Dicer酶结合后，被切成长度为21-23bp的小干扰RNA分子(small interfering RNA，siRNA)。siRNA识别并结合靶基因mRNA上的互补序列，引导RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)将mRNA降解，从而导致靶基因转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)。具有茎环结构的短发夹RNA(shorthairpin RNA，shRNA)在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，并诱导RNA干扰，而且作用时间更为持久。针对目的基因序列构建shRNA表达载体，并导入细胞内，可以长效、特异性的干扰靶基因的表达，实现类似于基因敲除的效果。RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一。该技术已被广泛用于探索基因功能等方面的研究。

经对现有技术的文献检索发现，尚无细胞周期蛋白F基因的RNA干扰序列的有关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种抑制鸡细胞周期蛋白F基因表达的shRNA分子序列。根据Genbank数据库中鸡细胞周期蛋白基因序列以及shRNA的分子序列设计原则，设计多个shRNA分子序列，根据设计经验和设计软件进行评估测定，选择4条最佳的动力学参数靶点进入后续试验流程。根据选择的4个干扰靶点序列设计并合成4个寡聚单链DNA序列。

本发明提供的作用于鸡细胞周期蛋白F基因mRNA的shRNA分子序列，为如下a)或b)或c)或d)：

a)由序列表的序列1所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；

b)由序列表的序列2所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；

c)由序列表的序列3所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸；

d)由序列表的序列4所示核苷酸序列组成的单链寡核苷酸。