[发明专利]一种检测裂谷热病毒的引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于兽医病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测裂谷热病毒的引物组和探针。即应用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术检测裂谷热病毒所用到的引物及检测方法。

背景技术

裂谷热(Rift valley fever，RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)引起反刍动物和人发病的人兽共患病。裂谷热病毒可以通过蚊子或接触血液、体液、组织或患病动物而传播。本病对绵羊、山羊、牛的影响较为严重，可引起怀孕动物的流产和新生畜的死亡。大龄非怀孕动物也较易感，但临床抗病性较强，动物的易感性与其本身的遗传差异有关，来自非洲以外及RVF非流行地区的动物对本病较易感。人对RVFV易感，可通过接触、处理感染性材料或通过蚊虫媒介叮咬感染，人感染后通常无症状或者与主要的自身限制性的发热疾病相关。经过2－5天的潜伏期之后，病人可能经历一个流感样的疾病，伴随无显著特点的疲劳，低烧，头疼，畏光和关节疼痛。一些病人发展为昏倒。大量有症状的病人将呈现肝炎。发热通常持续一周，大部分自然康复，少于5％的病人将发展为综合征如肾炎、出血热或者脑炎，死亡率高达10－12％。

裂谷热主要在西非和其他一些非洲国家呈地方性流行，在强降雨后牲畜和人群中周期性流行。2000年病毒被传播到阿拉伯半岛，引起沙特和也门的疫情大暴发，这也是该病第一次被传播到在非洲大陆以外的地方，提示该病进一步扩散到其他地区的可能性进一步增大。目前已经建立了几种实时荧光RT-PCR方法来检测该病，但这些方法普遍需要高昂的仪器设备，并且无法满足田间检测的需要。为快速对裂谷热做出诊断，急需建立一种使用易读取系统基础之上的高灵敏性和特异性的实时检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测裂谷热病毒的引物及探针，从而弥补现有技术的不足。

本发明的引物及探针，其正向引物的序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2所示，探针序列为SEQ ID NO：3所示。

其中探针RVFV-RPAp中的第27个碱基标记BHQ1淬灭基团修饰，第28位碱基替换为四氢呋喃(tetrahydrofuran)，第29位碱基标记FAM发光基团修饰，3′末端进行磷酸化修饰。

本发明的引物及探针用于检测裂谷热病毒；

本发明还提供了一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测裂谷热病毒的方法：提取待检样品中的RNA作为模板，利用所述的引物和探针进行荧光快速检测，如果有明显的荧光曲线扩增，则说明所检测样品中含有裂谷热病毒核酸。

本发明根据裂谷热病毒基因组序列设计了大量RPA引物和探针，从中筛选出可快速有效检测裂谷热病毒核酸的引物及探针组合。利用该套引物和探针进行快速检测，以体外转录的裂谷热病毒核酸RNA作为阳性对照可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体和蓝舌病病毒为模板进行反应均没有扩增曲线。

附图说明

图1为裂谷热病毒特异性检测，其中1为裂谷热病毒阳性对照，2-6分别为口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体、蓝舌病病毒和健康羊淋巴结。

图2为检测灵敏度试验图，使用体外转录的RVFV RNA为模板，拷贝数从10⁶到10⁰低依次的检测阳性率。

具体实施方式

本发明通过对RVFV毒株进行序列比对后，获得病毒保守性较高的区域，然后从该区域设计引物及探针。所使用的引物和探针若检测出特异性荧光曲线则为RVFV毒株。

下面通过具体实施方式的详细描述进一步阐明本发明。对于本发明具体实施例中所采用的方法步骤，本领域的普通技术人员可以从现有技术中进行选择替换，而并不仅限于本发明的具体记载。

实施例1：RPA检测RVFV方法的建立

根据GenBank中裂谷热病毒基因组序列，设计引物和探针。引物长度约为30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出一对灵敏度高且特异性好的引物，引物和探针序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、和SEQ ID No.3(表1)。

表1：用于RPA检测RVFV的引物和探针