[发明专利]一株须糖多孢菌丁烯基多杀菌素高产突变株

说明书

技术领域

本发明涉及一株须糖多孢菌丁烯基多杀菌素高产菌株，采用核糖体工程技术，使用高浓度链霉素对原始菌株进行抗性筛选，获得了一株高产丁烯基多杀菌素的链霉素自发抗性突变株S13，并且通过超高效液相色谱及质谱对丁烯基多杀菌素进行了检测鉴定。

背景技术

多杀菌素及其衍生物作为高效、环保、安全的抗生素类生物杀虫剂，已成为近几年生物杀虫制剂研究领域的一大热点。丁烯基多杀菌素是由须糖多孢菌S.pogona产生的一类与多杀菌素结构类似的大环内酯类化合物，这类化合物具有很好的杀虫、杀螨活性。到目前为止，丁烯基多杀菌素组分共检测到31种，且丁烯基多杀菌素比多杀菌素具有更为广泛的杀虫谱，包括鳞翅目（Lepidoptera）、缨翅目（Thysanoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、双翅目（Diptera）等多种害虫，尤其对鳞翅目、缨翅目害虫具有极强的选择性杀虫活性，对多杀菌素难于控制的世界性检疫性害虫苹果蠹蛾和重要农业害虫烟青虫具有良好的生物防治作用。它们的杀虫作用机制是通过与烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）、γ-氨基丁酸受体（GABARs）结合使昆虫神经细胞去极化，引起中央神经系统超活化，从而导致昆虫非功能性肌肉收缩、震颤，最后衰竭、瘫痪直至昆虫死亡。对靶标昆虫表现出快速触杀和摄食毒性的双重作用，具有低毒、低残留、对害虫的天敌安全、自然分解快等优点，兼具生物农药的安全性与化学农药的高效性，是当前国际上极具发展前景的环境友好型生物农药。

目前国际上关于丁烯基多杀菌素的研究仍处在起步阶段，野生型须糖多孢菌菌株中丁烯基多杀菌素产量极低，因此如何提高其发酵产量是亟待解决的一大难题。

须糖多孢菌全基因组序列未知且拥有严格限制性修饰系统，难以通过基因重组的方法来进行菌种改良。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株须糖多孢菌丁烯基多杀菌素高产突变株，利用核糖体工程技术，使用链霉素对须糖多孢菌S.pogona进行抗性选育，获得丁烯基多杀菌素高产菌株。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，

一株须糖多孢菌丁烯基多杀菌素高产突变株，即须糖多孢菌S13，Saccharopolyspora pogona S13，该菌种于2015年05月26日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2015324。

本发明之须糖多孢菌丁烯基多杀菌素高产突变株，获得步骤如下：

（1）须糖多孢菌原始菌株链霉素最低抑制浓度的测定；

（2）大量须糖多孢菌链霉素抗性突变株的筛选；

（3）超高效液相色谱（UHPLC）分析突变菌株丁烯基多杀菌素的生物合成能力；

（4）质谱(MS)检测鉴定须糖多孢菌丁烯基多杀菌素各个组分；

（5）高产丁烯基多杀菌素突变株突变位点鉴定；

（6）突变株稳定期差异表达蛋白水平分析。

核糖体是生物进行蛋白质合成的重要细胞器，与胞内代谢活动、基本生理过程密切相关。核糖体发生突变不仅导致微生物形态、性状等方面发生变化，还可显著影响胞内物质的代谢。核糖体工程技术是以微生物的各类抗生素抗性突变为筛选标记，高效获得次生代谢产物合成能力提高的突变株的一种育种新方法。核糖体工程技术从研究核糖体蛋白结构上的突变对微生物次级代谢调控作用的影响出发，是通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或RNA聚合酶进行修饰改造，带来其结构和功能上的改变，影响微生物次级代谢产物的调控途径，进而激发微生物的生物合成潜能，大幅度提高其次级代谢产物的产量甚至从中获得新的生物活性物质，获得代谢产物合成能力提高的突变菌株。与其他的育种方法相比，核糖体工程技术不需了解菌株的遗传信息，不需进行遗传操作，简单易行，无需特殊设备，便于高通量的筛选。