[发明专利]施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类种质的鉴定，具体涉及一种施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其应用。

背景技术

鲟形目鱼类是地球现存最古老的鱼类之一，有“活化石”之称。施氏鲟 （Acipenser dabryanus） 属鲟形目、鲟科、鲟属，俗名七粒浮子等，主要分布于黑龙江水系，自下游至上游额尔古纳河及石勒喀河等；多数分布于黑龙江中游和松花江下游，乌苏里江较少。由于过度捕捞和水体污染等原因，施氏鲟的资源量已经急剧减少。施氏鲟2010年被世界自然与资源保护联盟(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources简称IUCN)红色名录列为极度濒危(Critically Endangered, CR)物种，具有很高的经济价值和科研价值。

目前对于鲟形目鱼类的鉴定主要采用形态学和分子生物学等方法，由于形态学不适用于鱼子酱等鲟鱼产品的鉴定，通常采用线粒体上的分子标记鉴定鲟鱼及其产品。如Boscari等（Boscari, E., et al., Species and hybrid identification of sturgeon caviar: a new molecular approach to detect illegal trade.Molecular ecology resources, 14(3): 489-498. May 2014 DOI: 10.1111/1755-0998.12203 ISSN 1755-098X）采用线粒体D-loop和S7对施氏鲟进行了鉴定，对施氏鲟的鉴定准确性不高，操作繁琐。因此，亟待开发出能够简便快速、准确检测施氏鲟与其他鲟鱼的分子鉴定技术，用于放流等种质鉴定，监管施氏鲟产品等。

中国专利申请号200510010346.0，名称为“一种鉴定史氏鲟、达氏鳇的技术”的发明专利，它是在施氏鲟、达氏鳇及其产品DNA检测中使用具有种属特异性的DNA分子标记AHN，AHN引物大小为10bp，碱基序列为cacccggatg。用此引物对施氏鲟、达氏鳇及其产品DNA进行PCR检测，施氏鲟可获得200bp电泳带，达氏鳇则无此带，达到对两种鱼及其产品进行鉴定、标识的目的。该专利方法仅能在一定程度上鉴定出施氏鲟，区分施氏鲟与达乌尔鳇，适用范围窄。因此，亟待开发出能够简便快速、准确检测施氏鲟与其他鲟鱼的分子鉴定技术，用于放流等种质鉴定和市场监管等。

发明内容

本发明为了鉴定施氏鲟及其产品，从分子生物学层面上将形态上不易区分的施氏鲟或其产品进行鉴定，提供了一种施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒及其使用方法。本发明在鲟科鱼类中筛选核基因片段作为分子标记，应用核基因片段SNP位点，成功鉴定了施氏鲟，同样适用于施氏鲟产品的鉴定。

SNP （single nucleotide polymorphism，SNP）是单个核酸差异的分子标记技术，在物种鉴定领域，方法是依据同一个目的基因序列在近缘物种间的单个碱基的差异，进而用于研究种群遗传变异和物种鉴定。

fzd8是卷曲蛋白基因片段，利用fzd8上含有的单核苷酸多态性（SNP）位点，用于施氏鲟的种质鉴定，具有实验准确快捷，操作简便，适用范围广等优点。

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一方面，本发明涉及施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒，包括fzd8基因片段的特异性引物。进一步地，所述试剂盒还包含PCR试剂；优选地，所述PCR试剂为：2.5μL 含Mg²⁺的Taq酶10× buffer； 2.5 mM dNTPs 1 μL；25 pM上游引物0.5 μL；25 pM 下游引物0.5 μL； 2.5 U μL^-1 Taq DNA聚合酶 0.2 μL；19.8 μL超纯水。

使用时加入0.5μL待检测样本的DNA（约50 ng）。

另一方面，本发明涉及所述施氏鲟种质分子标记鉴定试剂盒在鉴定施氏鲟或其产品中的应用；优选地，所述应用是将施氏鲟或其产品从其他鲟鱼或其产品中鉴定出来；优选地，所述其他鲟鱼为达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟及达乌尔鳇的任意一种或者多种。

所述的施氏鲟产品或其他鲟鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头、皮制品等。

本发明所述fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：

正向引物： 5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ （SEQ ID NO:8）；