[发明专利]微小RNA的固相芯片恒温检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，是一种通过固相芯片恒温指数扩增的方式定性和定量检测多种微小RNA(microRNA,miRNA)的固相芯片恒温检测方法。

背景技术

与基因组DNA、mRNA和长片段非编码RNA(lncRNA)等核酸分子相比较，微小RNA(microRNA,miRNA)分子具有其特殊性，如：核酸分子片段极小(≤22nt)，GC含量分布广泛(5～95％)，导致熔解温度(meltingtemperature，Tm)差异大，难于设计匹配的扩增引物和检测探针；所占总RNA的比例极低(≤0.01％)，需要高灵敏度的检测方法；家族分子差异小(可仅有单碱基差异)，对检测特异性的要求高；不同miRNA的表达水平差异极大(可达4个数量级；如：几十个拷贝/细胞至5×10⁵拷贝/细胞)，要求检测线性范围宽，同时能够有效识别低丰度miRNA；靶序列同时存在于pri-miRNA和pre-miRNA中；缺乏类似于mRNA的poly(A)尾，使其难以用常规技术手段进行逆转录检测。miRNA的上述特征对其核酸分子检测技术和方法提出了近乎于苛刻的特殊需求。例如，极小的分子片段使常规PCR引物设计策略无法实施，单碱基差异对引物或探针的碱基分辩能力要求极高，GC含量的巨大差异导致引物和探针难于取向于均一的退火温度。

自1993年首次发现miRNA以来，miRNA的检测方法从NorthernBlot探针杂交法逐渐向高通量测序法(如：Solexa法和SoLiD法等)、芯片杂交法、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,ISH)、实时荧光逆转录定量PCR法(real-timereversetranscriptionquantitativePCR,RT-qPCR)、恒温扩增检测技术发展。由于miRNA靶分子的上述独特属性，现有的每种检测技术和方法特点各异，各有所长，但也都有明显的缺点，从而使每种方法都有其最适合的使用环境。

以目前最常用的基于芯片杂交法的微阵列技术、高通量测序法和RT-qPCR为例。高通量测序与微阵列的检测通量大，并且，高通量测序还可用于发现新miRNA，但是，这两种方法的定量精确性较差，价格昂贵，一般应用于miRNA的初筛研究。此外，高通量测序技术文库制备复杂，达到兆字节(terabytes,TB)的庞大和复杂文库数据分析需要特殊的计算机资源和相关的生物信息学工具和手段，因此，往往由专业的公司提供。由于miRNA的片段小，且Tm值差异大，微阵列技术不能简单地通过增加和减少探针的长度来均衡不同探针的杂交效率，因此，往往需要借助一些特殊的技术手段，例如使用锁核酸探针(lockednucleicacid,LNA)。以茎环引物RT-qPCR、poly(T)接头RT-qPCR为代表的RT-qPCR技术是验证基因组水平miRNA表达谱研究结果最常用和最经典的方法，但是该技术均需逆转录步骤，受多种因素制约的实验数据归一化对检测结果精确度影响大，“热变性-复性-延伸”热循环条件需要高纯度的miRNA，此外，扩增效率受到多种因素的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时；受限于热动力学特征，无法精确检测2倍以下的表达差异。

理想的miRNA检测方法应当具有以下特征：灵敏度高，能够达到检测少量或微量起始材料；特异性好，能够识别仅有单碱基差异的miRNA；操作简便，无需昂贵的试剂和设备；通用性高，能够应用于miRNA的组织和细胞原位检测、高通量检测、精确定量检测等多个领域。但是，如上所述，受限于miRNA靶分子的特有属性及现有技术的固有局限性，miRNA的现有检测技术往往只能满足上述部分需求。如果能够研发出一种新的能够更好地满足上述需求的技术和方法，一方面，能够得到更广泛的应用，例如，采用一种技术和方法就能实现多个领域的应用，从而有效地拓展非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)的研究深度与广度。

恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于以PCR为代表的变温扩增技术，恒温扩增技术具有以下主要优势：反应温度单一，对设备的要求程度低；不存在温度变化，扩增效率及核酸扩增片段长度均优于常规PCR技术；反应时间短，可在1小时，甚至几分钟内实现靶分子的有效扩增，且灵敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且，特别适合于miRNA的检测。