[发明专利]一种恩拉霉素产生菌株的构建方法及相关基因

说明书

本发明涉及一种恩拉霉素高产菌株的构建方法及相关基因和菌株；相关基因序列如序列1所示，同时提供含有如权利要求所述的恩拉霉素产量高且链霉素抗性好的基因工程菌株P1。本发明首先针对目前工业生产用恩拉霉素产生菌P建立并优化了出一套简便易行的遗传转化体系，并首次利用定点突变技术对该菌株中的核糖体蛋白(S12)编码基因rpsl进行了定点改造，同时对改造后菌株的产素水平及生理生化特性进行了研究。结果显示：工程菌Streptomyces fungicidicus P1的恩拉霉素产量与原始菌株相比提高了约20﹪，同时该菌株对链霉素的抗性提高了至少10倍。

技术领域

本发明属于工业微生物分子育种领域，以目前恩拉霉素生产用菌株Streptomyces fungicidicus F1为出发菌株，通过对其核糖体蛋白编码基因进行定点改造来达到提高其恩拉霉素产量的目的。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)又名持久霉素，是由土壤中的放线菌发酵产生的一种非核糖体多肽(NRP)类抗生素，对革兰氏阳性菌特别是禽畜肠道内有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用；饲料中添加适量的恩拉霉素不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。同时恩拉霉素具有广谱、低毒、无残留、不易产生耐药性和交叉抗性等优点，因此是目前少数几种可用于饲料添加剂的抗生素之一。目前恩拉霉素的生产主要由抗真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)发酵获得，由于该菌株发酵周期长，产素水平低，限制了恩拉霉素的大规模生产和进一步的推广应用，因此对恩拉霉素产生菌进行菌种改良以提高其产素水平及生产性能具有重要的应用价值和研究意义。

上世纪90年代，Shimg等人发现在Streptomyces lividans的核糖体蛋白S12 编码基因rpls中引入某些突变位点，可激活该菌株中某些沉默基因的表达，并导致放线紫红素的过量合成。随后的大量研究表明：在其它放线菌及芽孢杆菌中的核糖体编码基因中引入特定突变均可对这些菌株中的次级代谢产生重大影响，并导致抗生素、细胞色素等次级代谢物的大量合成。核糖体编码基因的改变往往会导致核糖体结构和功能的改变，而某些核糖体结构的改变可反映为对作用于核糖体上的抗生素的抗性发生变化，因此通过筛选或构建相应的抗性突变，可获得核糖体结构和功能突变的菌株,进而获得次生代谢产物合成能力提高的菌株。因此可以这些抗性突变为筛选标记建立一种简单易行的微生物菌种育种方法，即核糖体工程。目前与核糖体工程相关的几种抗性突变主要有：链霉素抗性突变、利福平抗性突变、晚霉素抗性突变、硫链丝菌素抗性突变以及夫西地酸抗性突变等。其中链霉素抗性突变在选育抗生素高产菌株中应用最多。例如，Hosoya等在 Streptomyceschattanoogensis突变株中随机筛选出50至100株链霉素抗性突变株，并对其Fredericamycin的合成能力进行了检测，结果显示约有1/2的突变菌株其抗生素合成能力明显提高，产量最高的可达野生菌株的26倍。此外，在蜡状芽胞杆菌和吡诺尼群假单胞菌的链霉素抗性突变株中出现抗生素高产突变株的比例为7﹪到30﹪，并且有枯草芽孢杆菌链霉素抗性突变株的抗生素产量比野生型菌株提高了50倍的报道。然而，目前对恩拉霉素产生菌Streptomyces fungicidicus的核糖体工程改造尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恩拉霉素高产菌株的构建方法，和一株恩拉霉素高产工程菌。本发明的目的在于通过基因工程手段以及核糖体工程手段来提高 Streptomycesfungicidicus P(Streptomyces fungicidicus ATCC 21013)的恩拉霉素产量,该方法是分子生物学方法的一种,通过点突变Streptomyces fungicidicus P染色体上的rpsL基因,达到提高恩拉霉素产量的目的。

本发明的目的是这样实现的：

一种针对恩拉霉素产生菌的遗传转化及分子改造方法，步骤如下：