[发明专利]一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法

说明书

一、技术领域：

本发明涉及伪结核棒状杆菌的检测技术领域，具体涉及一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。

二、背景技术：

山羊干酪性淋巴结炎（Caseous Lymphadenitis，CLA）（又称山羊伪结核）是由伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis，C.p)引起的以淋巴结肿大为主要特征的一种慢性人兽共患病，主要感染山羊和绵羊，分为体表型和内脏型两种。患病畜及隐性感染动物可通过鼻分泌物、排泄物以及破溃的脓肿流出的浓汁向外界排放大量的病原体，病原体通过直接或间接接触感染健康羊只并造成土壤、水、食物、牧草地的污染。患病羊产奶量下降、产毛量减少、繁殖能力减弱，在食欲不明显减退的情况下逐渐消瘦，生产力下降的同时能源消耗不减，不仅增加了养殖成本，还引发羊肉、羊奶鲜乳等动物性食品病原微生物及兽药残留严重超标，带来食品安全隐患。临床上对体表型脓包病羊通常可以采取治疗或淘汰措施，但内脏型患病羊只无明显临床症状，较难及时发现采取相应措施。因此，内脏型患病羊只的有效诊断对于该病的防控十分重要。

目前，对于该病的病原学诊断方法有病原菌的分离培养与生化鉴定、协同溶血试验、PCR，但这些方法基本不适用于内脏型患羊的活体诊断。鉴于国内目前尚无伪结核疫苗，而患病羊血清中必然存在抗伪结核棒状杆菌抗体，因此，ELISA检测方法检测其抗体水平可有效反映羊只的感染情况。

目前，间接ELISA方法检测山羊伪结核抗体所用的包被抗原包括原核表达PLD蛋白、超声裂解的菌体蛋白。以原核表达的PLD蛋白做包被抗原时，特尔异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应。以超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测结果。本发明以完整山羊伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，检测结果特异性强，且重复性好，避免了上述两种包被抗原造成的缺陷。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，该方法操作简单，检测结果灵敏稳定，适用于大批量样本检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒。

包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mL LB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体，用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原。

配制不同浓度的包被抗原，确定包被抗原浓度对应的OD₆₀₀值在0.060～0.090之间。

界定了待检血清的临界值。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明以完整的伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，检测病羊血清中是否含有抗伪结核棒状杆菌的抗体，依此判断病羊是否感染伪结核，该诊断方法能够针对性的检测抗羊伪结核抗体，为伪结核防控提供有力监测手段。

四、具体实施方式：

本发明涉及的羊伪结核抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1．间接ELISA检测方法的建立

步骤一、包被抗原的制备

将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mL LB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体。用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液。此即为包被抗原。

步骤二、酶标板的包被

在分光光度计上调整伪结核棒状杆菌菌悬液的浓度使其OD₆₀₀在0.060～0.090范围，取菌悬液100μL/孔加至酶标板，置于4℃过夜。包被结束后，将PBST添加至酶标板，200μL/孔，轻微震荡10s后，弃掉酶标板中的PBST，重复洗涤3次，最后一次洗涤结束后于干净纱布拍干孔中残留PBST。

步骤三、封闭

取5%（百分比）脱脂奶粉，100μL/孔添加至酶标板，37℃封闭1～3h。封闭结束后洗涤，洗涤操作同步骤二。

步骤四、一抗血清的孵育